לכידת וזיהוי של RNA-מחייב חלבונים באמצעות לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome ללכוד אסטרטגיה (CARIC)
Summary
פרוטוקול מפורט להחלת לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome הלכידה (CARIC) האסטרטגיה כדי לזהות חלבונים איגוד כדי שני קידוד ו noncoding RNAs מוצג.
Abstract
מזהה מקיף של RNA-מחייב חלבונים (RBPs) הוא מפתח להבנת הרשת תקינה posttranscriptional בתאים. אסטרטגיה בשימוש נרחב עבור לכידת RBP מנצלת את פוליאדנילציה [poly(A)] של RNAs היעד, אשר מתרחשת בעיקר על האיקריוטים mRNAs בוגר, עוזב את רוב מחייב חלבונים של non-poly(A) RNAs לא מזוהה. כאן נתאר את הליכים מפורטים של שיטת דיווחו לאחרונה כינה לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome הלכידה (CARIC), אשר מאפשר לכידת transcriptome-wide RBPs הן poly(A) והן non-poly(A) על ידי שילוב של תיוג מטבולית של RNAs ויוו UV cross-linking, תיוג bioorthogonal.
Introduction
הגנום האנושי הוא עיבד לתוך סוגים שונים של קידוד ו noncoding RNAs (ncRNAs), כולל mRNAs, rRNAs, tRNAs, RNAs גרעיני קטן (snRNAs), קטן nucleolar RNAs (snoRNAs) ולונג ללא קידוד RNAs (lncRNAs)1. רוב אלה RNAs להחזיק בגדים של RBPs, לתפקד כמו חלקיקים (RNPs) ribonucleoprotein2. לכן, זיהוי מקיף של RBPs היא תנאי הכרחי להבנת הרשת תקינה בין RNAs RBPs, אשר הייתה שם מחלות אנושיות שונות3,4,5.
בשנים האחרונות עדים דחיפה גדולה של RBPs גילה שונים מערכות האיקריוטים2,6, כולל האדם7,8,9,10,11, העכבר12,13,14, שמרים9,15,16, דג זברה17, דרוזופילה melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16 תודרנית לבנה20,21,22, האדם טפילים23,24,25 . ההתפתחויות הללו יש כבר בהנחייתם של אסטרטגיית לכידת RBP שפותחה על ידי Castello. et al. 7 ו. Baltz et al. 8 ב 2012, המשלב ויוו UV cross-linking של RNA, שמעצבת חלבונים, לכידת oligo(dT) poly(A) RNAs, ושל ספקטרומטר מסה (MS)-מבוסס פרופיל פרוטיאומיה מבנית. עם זאת, בהתחשב בעובדה ש-poly(a) זה קיים בעיקר mRNAs בוגר, אשר חשבון עבור ~ 3% – 5% בלבד של transcriptome האיקריוטים26, האסטרטגיה הנפוצה הזו אינה מסוגלת ללכוד RBPs אינטראקציה עם non-poly(A) RNAs, כולל רוב ncRNAs pre-mRNAs.
כאן, אנו מדווחים על ההליכים מפורט של האסטרטגיה שפותחו לאחרונה ללכידתו transcriptome ברוחב של RBPs הן poly(A) והן non-poly(A)27. כינה CARIC, אסטרטגיה זו משלב ויוו UV cross-linking, תיוג מטבולית של RNAs עם photoactivatable ו- “לחיץ” nucleoside תחליפי (אשר מכילים קבוצה פונקציונלית bioorthogonal יכולים להשתתף תגובת לחץ), 4 – thiouridine (4SU), 5-ethynyluridine (האיחוד האירופי). השלבים הם המפתח להגיע לתוצאות אידיאלי עם האסטרטגיה CARIC הם תיוג מטבולית יעיל, התגובה cross-linking ולחץ UV, שמירה על שלמות RNA. כי Cu(I) משמש הזרז בתגובה לחץ יכול לגרום את הפיצול של RNAs, ליגנד Cu(I) שיכולים להפחית פיצול RNA הוא חיוני. אנו מתארים כיצד לבצע תגובות לחץ יעיל ב תא lysates מבלי לגרום השפלה RNA חמורה.
למרות RBP ללכוד, זיהוי בתאים הלה רק מתואר במסגרת פרוטוקול זה, ניתן ליישם את האסטרטגיה CARIC לסוגי תאים שונים ואולי אף אורגניזמים חיים. חוץ RBP לכידת, פרוטוקול זה מספק גם הליכים צעד אחר צעד יעיל עבור הכנת הדוגמא MS וחלבון וכימות, אשר יכול להיות שימושי עבור אלה שאינם מכירים פרוטיאומיה מבנית ניסויים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שמירה על תקינות RNA הוגן הוא אחד המפתחות ניסויים CARIC מוצלח. עם ליגנדים המתאים של Cu(I) ותפעול זהיר, השפלה RNA ניתן להפחתה, למרות ההשפלה חלקית נצפתה. יחס החלפה של האיחוד האירופי, 4SU בדגימות ניסיוני הם 1.18% ו- 0.46%, בהתאמה (נתונים לא מוצג). עבור RNAs שלמים באורך של 2,000 nt, ~ 90% של RNAs להכיל אחד לפחות של האיחוד הא?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין מענקים 91753206, 21425204, ועל 21521003 ועל ידי 2016YFA0501500 פרוייקט פיתוח ומחקר מפתח הלאומית.
Materials
| HeLa | ATCC | ||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Penicillin & Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| EU (5-ethynyl uridine) | Wuhu Huaren Co. | CAS:69075-42-9 | |
| 4SU (4-thiouridine) | Sigma Aldrich | T4509 | |
| 10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| UV cross-linker | UVP | CL-1000 | Equiped with 365-nm UV lamp |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma Aldrich | D5758 | To treat water. Highly toxic! |
| Tris·HCl, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | 62476 | |
| Nonidet P-40 | Biodee | 74385 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 88265 | One tablet for 50 mL lysis buffer. |
| LDS (Lithium dodecyl sulfate) | Sigma Aldrich | L9781 | |
| 15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC901024 | |
| 0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC501096 | |
| Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88816 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 41639 | |
| Azide-biotin | Click Chemistry Tools | AZ104 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
| THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] | Sigma Aldrich | 762342 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Azide-Cy5 | Click Chemistry Tools | AZ118 | |
| LDS sample buffer (4×) | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| 10% bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0301BOX | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | R6513 | |
| SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] | J&K | 315442 | |
| Triethanolamine | Sigma Aldrich | V900257 | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20353 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma Aldrich | 61743 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | 30970 | |
| MaxQuant | Version: 1.5.5.1 |
Referencias
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
- Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).
- Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).
- Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs – focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).
- Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
- Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
- Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).
- Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).
- Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).
- Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).
- Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).
- Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
- Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
- Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
- Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
- Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
- Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).
- Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12 (1), e0170068 (2017).
- Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
- Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).
- Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).
- Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).
- Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).
- Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).
- Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. , (2018).
