HIV 관련 간 병인을 위한 이중 인간화 TK-NOG 마우스 모델 구축
Summary
이 프로토콜은 인간 면역 계통 및 간 세포 둘 다로 인간화한 마우스를 설치하는 믿을 수 있는 방법을 제공합니다. 인간 간세포 및 CD34+ 조혈 줄기 세포의 경내 주사를 통해 달성된 이중 재구성 면역 결핍 마우스는 인간 면역 결핍 바이러스-1 감염에 취약하고 관찰된 바와 같이 간 손상을 재현합니다. HIV에 감염된 환자.
Abstract
인간 면역 결핍 바이러스-1 (HIV-1)에 감염된 환자의 기대 수명이 증가했음에도 불구하고 간 질환은 이환율의 일반적인 원인으로 나타났습니다. HIV-1에 기인한 간 면역 병리학은 애매하게 남아 있습니다. 인간 간세포및 인간 면역 계통을 가진 작은 이종이식 동물 모형은 질병의 병인의 인간 생물학을 되풀이할 수 있습니다. 본 명세서에서, 프로토콜은 인간 간세포 및CD34+ 조혈줄기/전구세포(HSPC) 이식을 통해 이중 인간화된 마우스 모델을 확립하고, HIV 감염 환자에서 관찰된 바와 같이 간 면역병리학을 연구하기 위해 기술된다. 이중 재구성을 달성하기 위해, 남성 TK-NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg (Alb-TK)7-2/ShiJic) 마우스는 쥐 형질전환 간 세포를 제거하기 위해 간시 클로비르 (GCV) 투여량으로 복강 내 주입, 그리고 비 myeloablative 컨디셔닝을위한 treosulfan, 둘 다 인간 간세포 (HEP) 생착 및 인간 면역 체계 (HIS) 개발을 용이하게합니다. 인간 알부민(ALB) 수준은 간 생착에 대해 평가되고, 유세포측정에 의해 검출된 혈액내 인간 면역 세포의 존재는 인간 면역 계통의 확립을 확인한다. 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 개발된 모델은 HIV-1 감염으로 인한 간 손상의 여러 구성 요소와 유사합니다. 그것의 설립은 간염 바이러스 공동 감염의 연구 결과 및 항 바이러스 및 항 레트로 바이러스 약물의 평가에 필수적인 증명할 수 있었습니다.
Introduction
항 레트로 바이러스 치료의 출현 이후, HIV-1 단독 감염과 관련된 사망이 상당히 감소했습니다. 그러나, 간 질환은 HIV 감염 환자에서 이환율의 일반적인 원인으로등장하고있다 1,2. HIV-1 감염을 가진 간염 바이러스의 공동 감염은 미국에 있는 HIV 감염한 사람의 10% – 30%를 차지하는 일반적입니다3,4,5.
HIV-1 및 간염 바이러스의 호스트 특이성은 인간 특정 전염병을 연구하거나 HIV-1 관련 간 병인의 다중 양상을 조사하기 위하여 작은 동물 모형의 유용성을 제한합니다. 인간 세포 및/또는 조직(인간화마우스 모델이라고 불등)의 생생을 허용하는 면역결핍 마우스는 전임상연구에서6,7,8에허용되는 동물 모델이다. 2000 년대 초반에 인간화 된 마우스의 도입 이후, 담즙 정체 인간의 간 독성의 여러 전임상 연구, HIV-1 및 HIV 관련 신경 인지 장애를 포함한 인간 특정 병원체, 엡스타인 바 바이러스, 간염, 기타 감염성 질환은, 이들 마우스6,9,10,11에서조사되었다. CD34+ HSPC 및/또는 인간 간세포 이식에 대한 다중 마우스 모델은 오랫동안 개발되어 왔으며 시간이 지남에 따라 B형 간염 바이러스(HBV)-관련 간 질환의 질병 발병기전을 연구하기 위해 개선되었습니다12. 13세 , 14. HSPC 및 인간 간세포 (HEP) 이식에 대한 여러 모델은 NOG (NOD)로 알려진 균주를 기반으로합니다. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13,NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15,Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12,및 fah-/- NOD rag1-/- il2rγnull 마우스16. 그러나 각 모델에는 고유한 장점과 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, BALb/C-Rag2-/- γc-/- 배경상에 있는 HEPs 및 인간 줄기 세포(HSC)를 위한 AFC8 이중 인간화 마우스는 면역 세포와 HSC의 성공적인 생착을 가능하게 하지만 항원 특이적 T-및 B 세포의 부재가 있습니다. 이 모델12의응답 . 이중 인간화 마우스를 재구성하는 주요 관심사는 최적이 아닌 생착, 다른 조직을 지원하기위한 적합한 모델의 부족, 불일치 조건, 면역 거부, 또는 이식편대– 숙주 질환 (GVHD) 및 기술 신생아와 함께 위험한 조작과 신진 대사 이상으로 인한 높은 사망률과 같은 어려움13.
인간화마우스는17, 18,19년동안 HIV 연구에 사용되어 왔지만, HIV-1에 의한 간 손상을 연구하기 위해 인간화된 마우스의 사용은20개에제한되어 왔다. 우리는 이전에 이중 인간화 TK-NOG 마우스 모델의 설립과 HIV 관련 간 질환에 그것의 응용 프로그램의설립을보고 8. 이 모형은 간 및 면역 세포의 강력한 생착을 보여주고 HIV 감염 병인을 되풀이합니다. 이 토론은 인간 간세포의 이식에 있는 가장 중요한 단계를 포함하여 상세한 프로토콜을 제출합니다. HEPs의 성공적인 생착 및 TK-NOG 마우스에서 기능성 면역 계통의 확립에 필요한 HSPC에 대한 설명도 제시된다. HIV 관련 간 면역요법을 연구하기 위하여 이 마우스의 사용은 상세한입니다. 간특이적 포진심플렉스 바이러스 타입 1티미딘 키나아제(HSV-TK)를 운반하는 TK-NOG 수컷 마우스가 이식유전자를 사용한다. 이 이식유전자를 발현하는 마우스 간 세포는 GCV의 비독성 용량에 잠깐 노출된 후에 쉽게 절제될 수 있다. 이식된 인간 간 세포는 외인성 약물 없이 마우스 간 내에서 안정적으로유지된다(21). 마우스는 또한 인간 세포에 대한 마우스 골수에 틈새 시장을 만들기 위해 treosulfan의 비myeloablative 복용량으로전제조건8. 면역결핍 TK-NOG 마우스는 HEPs 및 다능성 HSPC로 경내 주사된다. 마우스는 혈액 면역 phenotyping 및 혈청 인간 알부민 수준의 측정에 의해 혈액과 간 재구성을 위해 정기적으로 모니터링됩니다. 인간 면역 세포와 HEPs 둘 다에 대해 15% 이상의 성공적인 재구성을 가진 마우스는 복강 내 HIV-1로 주입됩니다. 간장에 대한 HIV의 효과는 감염 후 4 – 5 주 일찍 평가 할 수 있습니다. HIV-1이 사용되기 때문에 바이러스를 처리하고 마우스에 주입하는 동안 필요한 모든 예방 조치를 취해야합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
간은 HIV에 감염된 환자24에서손상되고 손상됩니다. HIV-1의 존재에 있는 인간적인 간 질병을 공부하기 위한 실험적인 작은 동물 모형은 CD34+ HSPC 및 간세포7,12를가진 몇몇 공동 이식한 동물 모형의 가용성에도 불구하고, 극단적으로 제한됩니다 25. 시험관 내 실험에서, 간세포는 낮은 수준의 HIV-1 감염<su…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 보건 원 보조금 R24OD018546에 의해 지원되었다 (L.Y.P. 및 S.G.에). 저자는 외과 적 절차에 도움을 Weizhe 리, 박사, 박사, 아만다 지점 우즈, B.S., 면역 신체 에 대한 얀 청, UNMC 흐름 세포 분석 연구 시설 회원 이사 필립 헥슬리, 박사, 빅토리아 B. 스미스, B.S., 및 사만다에 도움을 감사드립니다 월, B.S., UNMC 고급 현미경 핵심 시설 회원 제니스 A. 테일러, B.S., 제임스 R. Talaska, B.S., 기술 지원을 위해. 저자는 TK-NOG 마우스와 테오술판을 제공하는 요아킴 바움가르트 박사를 제공한 CIEA의 이토 마모루 박사와 스에미즈 히로시 박사를 인정합니다. 저자는 원고에 그녀의 편집 기여에 대한 박사 아드리안 Koesters, UNMC, 감사합니다.
Materials
| 27G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
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