Erkennung von Protease-Aktivität durch fluoreszierende Peptid Zymography

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für eine modifizierte Zymographic-Technik in der fluoreszierenden Peptide als abbaubare Substrat anstelle von native Proteine verwendet werden. Elektrophorese von biologischen Proben in fluoreszierenden Peptid-Zymogramme ermöglicht die Detektion eines breiteren Spektrums von Proteasen als frühere Zymographic Techniken.

Abstract

Der Zweck dieser Methode ist es, die proteolytische Aktivität von komplexen biologischen Proben zu messen. Die Proben werden durch Molekulargewicht mit Elektrophorese durch eine Lösung von Gel eingebettet mit einem abbaubarem Substrat getrennt. Diese Methode unterscheidet sich von traditionellen Gel Zymography, dass eine abgeschreckt Fluorogenic Peptid in der Lösung von Gel statt voller Länge Proteine, wie Gelatine oder Kasein kovalent eingearbeitet ist. Verwendung der Fluorogenic Peptide ermöglicht direkte Nachweis der proteolytischen Aktivität ohne zusätzliche Färbung Schritte. Enzyme in den biologischen Proben cleave das abgeschreckt Fluorogenic Peptid, was zu einem Anstieg in Fluoreszenz. Das Fluoreszenzsignal in die Gele ist dann mit einem standard Leuchtstofflampen Gel Scanner abgebildet und quantifiziert mit Densitometrie. Die Verwendung von Peptiden als abbaubare Substrat erweitert erheblich die möglichen Proteasen nachweisbar mit Zymographic Techniken.

Introduction

Gel Zymography ist ein biologischer Verfahren zur Messung der proteolytischen Aktivität in biologischen Proben, z. B. Körperflüssigkeiten oder Zelle Nährmedien^1,2,3. Die Proben werden durch ihre Molmassen mit Elektrophorese durch ein Polyacrylamid-Gel eingebettet mit einem abbaubarem Substrat getrennt. Gemeinsamen abbaubaren Substrate enthalten Gelatine, Kasein, Kollagen und Elastin, die verwendet wurden, um die Aktivität von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) -1,-2-3, -7,-8,-9 und-11, neben einer Vielzahl von Cathepsins^1,2 messen ^{, 4 , 5 , 6 , 7 , 8}. nach Elektrophorese, die Enzyme sind renaturierte und durfte um das Protein innerhalb des Gels zu degradieren. In traditionellen Gel Zymography das Gel wird mit einem Protein-Farbstoff, z. B. Coomassie Blau gefärbt und Protease-Aktivität wird als Verlust des Signals, d. h. weiße Bänder (Abbau von Protein) auf einem dunkelblauen Hintergrund erkannt.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine alternative Methode der Gel Zymography, in dem das abbaubare Substrat kurzer Fluorogenic Peptid kovalent in das Polyacrylamid-Gel (Abbildung 1) integriert ist. Die Substitution von synthetische Peptide als abbaubare Substrate ermöglicht eine Erfassung von einer breiteren Palette von Proteasen im Vergleich zu traditionellen Gel Zymography mit native Proteine⁹. Kovalente Bindung des Peptids Fluorogenic verhindert Peptid Verbreitung und Migration während der Gelelektrophorese mit bisherigen Methoden^9,10beobachtet. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines Substrates Fluorogenic direkte Nachweis der Protease-Aktivität ohne zusätzliche Färbung und de-Färbung Schritte. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Erkennung von Protease-Aktivität in biologischen Proben über die kovalente Einbeziehung Fluorogenic Peptide in Zymogram Gele.

Protocol

1. Vorbereitung der Lösung von Gelschicht Bereiten Sie eine 10 %-Polyacrylamid-Gel-Lösung gemäß Tabelle 1zu lösen. Fügen Sie die Tetramethylethylenediamine (TEMED) und Ammonium Bleichen (APS) unmittelbar vor dem Gießen des Gels wie ihre Ergänzung die Polymerisationsreaktion initiiert. Füllen Sie eine leere 1,5 mm Mini-Gel Kassette auf halbem Weg (5 mL) mit 10 % ige Lösung von Gel-Lösung. Fügen Sie eine dünne Schicht von Isopropanol (~ 500 µL) an die Spitze der …

Representative Results

Mit der beschriebenen Methode hier, zwei fluoreszierende Protease-abbaubar Peptide flossen in Polyacrylamid-Gele: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (abgekürzt als QGIW in den Text und Zahlen) und GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (abgekürzt als LACW im gesamten Text und Zahlen). ↓ gibt die Site der Spaltung. QGIW ist ein Kollagen-ich abgeleitet Sequenz entwickelt, um zelluläre Collagenases14erkennen. LACW ist eine Sequenz, die für die Erkennung …

Discussion

Aktuelle Zymographic Techniken beruhen auf dem Einbau von nativen Substraten in Polyacrylamid-Gele für den Nachweis der Proteolyse. Während diese Techniken weit verbreiteten Einsatz angesammelt haben, werden sie noch in der Anzahl der Proteasen beschränkt, die Sie erkennen können. Hier wurde ein Protokoll beschrieben, in welche Leuchtstofflampen, Protease-abbaubar Peptide in der Polyacrylamid-Gel zu lösen integriert sind. Kovalente Kupplung mit ermöglicht ein Linker Azido-PEG3-Maleimide-Molekül die Trennung und Na…

Materials

1.5 mm Empty Gel Cassettes	ThermoFisher Scientific	NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs	ThermoFisher Scientific	NC3510
1x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	10-010-049
20% SDS Solution	Ambion	AM9820
3x Zymography Sample Buffer	Bio-Rad	1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)	Ambion	AM9022
6 Well Tissue Culture Plates	ThermoFisher Scientific	087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)	Sigma-Aldrich	UFC201024
Ammounium Persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit	Click Chemistry Tools	AZ107
Calcium Chloride	ThermoFisher Scientific	BP510100
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles	Fisher Scientific	14-826
Round Bottom Flask (100 mL)	Fisher Scientific	50-873-144
Septum Rubber Stopper	Fisher Scientific	50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)	Fisher Scientific	14-823-434
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trizma hydrochlroide	Sigma-Aldrich	T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager	GE Amersham	8149-30-9410
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	208086