זיהוי של פרוטאז פעילות על-ידי ניאון פפטידים Zymography
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור טכניקה שונה zymographic שבו ניאון פפטידים משמשים את המצע מתכלה במקום חלבונים מקורית. אלקטרופורזה של דגימות ביולוגיות בפפטיד פלורסנט zymograms מאפשר זיהוי של מגוון רחב יותר של פרוטאזות מאשר טכניקות zymographic הקודם.
Abstract
מטרת שיטה זו היא למדוד את הפעילות הפרוטאוליטי של דגימות ביולוגיות מורכבות. הדגימות מופרדים באמצעות משקל מולקולרי באמצעות אלקטרופורזה באמצעות ג’ל פתרון מוטבע עם מצע מתכלה. שיטה זו שונה zymography ג’ל מסורתיות בכך fluorogenic מתרצה פפטיד הוא שולב covalently הג’ל פתרון במקום חלבונים באורך מלא, כגון ג’לטין או קזאין. השימוש פפטידים fluorogenic מאפשרת זיהוי ישיר של פעילות הפרוטאוליטי ללא שלבים נוספים מוכתמים. אנזימים בתוך דגימות ביולוגיות קליב פפטיד fluorogenic מתרצה, וכתוצאה מכך עלייה בזריחה. האות פלורסנט, ג’לים ולאחר מכן עם תמונה עם סורק ג’ל פלורסנט רגיל, לכמת באמצעות densitometry. השימוש של פפטידים המצע מתכלה מאוד מרחיבה של פרוטאזות אפשרי לזיהוי בטכניקות zymographic.
Introduction
ג’ל zymography היא טכניקה ביולוגי למדידת פעילות הפרוטאוליטי בתוך דגימות ביולוגיות, כגון נוזלי הגוף או תא תרבות המדיה1,2,3. הדגימות מופרדים באמצעות משקולות מולקולרית שלהם עם אלקטרופורזה באמצעות ג’ל לזיהוי מוטבע עם מצע מתכלה. מצעים מתכלה נפוצים כוללים ג’לטין, קזאין, קולגן ואלסטין, אשר שימשו כדי למדוד את הפעילות של מטריקס metalloproteinases (MMPs)-1,-2,-3,-7, -8,-9 ו-11, בנוסף למגוון cathepsins1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. לאחר אלקטרופורזה, האנזימים renatured הינם מותרות כדי להשפיל את החלבון בתוך הג’ל. Zymography ג’ל מסורתיים, הג’ל הוא מוכתם צבע חלבון, כגון כחול Coomassie, ולאחר פעילות פרוטאז מתגלה כמו איבוד אות, קרי, לבנים להקות (השפלה של חלבון) על רקע כחול כהה.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור שיטה חלופית zymography ג’ל, שבו המצע מתכלה הוא קצר, פפטיד fluorogenic covalently שולבו הג’ל לזיהוי (איור 1). ההחלפה של peptides סינתטי בשם דיאלקטריים מתכלה מאפשר זיהוי של מגוון רחב יותר של פרוטאזות לעומת zymography ג’ל מסורתי עם חלבונים מקורית9. להצמדת קוולנטיות פפטיד fluorogenic מונע פעפוע פפטיד והעברה במהלך בג’ל נצפתה עם שיטות קודמות9,10. יתר על כן, השימוש של מצע fluorogenic מאפשרת זיהוי ישיר של פעילות פרוטאז מבלי להכתים נוספים וצעדים מבטל את ההגדלה. המטרה הכוללת של שיטה זו היא הגילוי של פעילות פרוטאז דגימות ביולוגיות באמצעות שיתוף קוולנטיות פפטידים fluorogenic zymogram ג’ל.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקות zymographic הנוכחיים מסתמכים על שילוב של סובסטרטים יליד לתוך לזיהוי ג’לים איתור proteolysis. ואילו טכניקות אלה משכו השימוש הנרחב, הם עדיין מוגבלים במספר של פרוטאזות שהם יכולים לזהות. . הנה, פרוטוקול תוארה בפפטידים פלורסנט, פרוטאז-מתכלים אשר משולבים של לזיהוי פתרון ג’ל. קוולנטיות צימוד באמצעות…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון מסופקים על ידי אוהיו סטייט אוניברסיטת להנדסה, המחלקה להנדסה ביו-רפואית של מקיף במרכז לחקר הסרטן – ארתור ג ג’יימס סרטן החולים ו ריצ’רד ג’ Solove מכון מחקר.
Materials
| 1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
| 1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| 20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
| 3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
| 40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
| 6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
| Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
| Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
| Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
| Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
| Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
Referencias
- Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).
- Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
- Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).
- Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).
- Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).
- Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. , 43-52 (2017).
- van Beurden, P. A. M. S. n. o. e. k. -., Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).
- Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. , 63-76 (1999).
- Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).
- Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, 79-102 (2017).
- Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -. L., Gatti, J. -. L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).
- Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).
- Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).
