In-vitro-Tests zur Bewertung der Migration, Invasion und Proliferation von verewigt menschlichen Ersttrimester-Trophoblast Zelllinien
Summary
Hier präsentieren wir eine hochverfügbare Protokoll für die Bewertung der Zellbewegung in menschlichen Trophoblast Zellen mit drei in-vitro-Tests: der Scratch-Test, Transwell Invasion Assay und der Zelle Verbreitung Assay.
Abstract
Zelle Bewegung ist eine wichtige Eigenschaft des Trophoblasten während plazentar Entwicklung und frühe Schwangerschaft. Die Bedeutung der richtigen Trophoblast Migration und Invasion zeigt Schwangerschaft Erkrankungen wie der Präeklampsie und intrauteriner Wachstumsretardierung, die mit unzureichenden Trophoblast Einmarsch in das mütterliche Gefäßsystem verbunden sind. Leider, unser Verständnis der Mechanismen, durch die die Plazenta von Migration entwickelt Trophoblasten ist begrenzt. In-vitro-Analyse der Zellwanderung über der Scratch-Test ist ein nützliches Werkzeug bei der Identifizierung von Faktoren, die Trophoblast wandernden Kapazität zu regulieren. Dieser Assay allein definiert jedoch nicht die Zellveränderungen, die veränderte Zelle Migration führen können. Dieses Protokoll beschreibt drei verschiedene in-vitro-Untersuchungen, die gemeinsam verwendet werden, um Trophoblast Zelle Bewegung zu bewerten: der Scratch-Test, die Invasion-Assay und der Verbreitung Assay. Die hier beschriebenen Protokolle können auch für den Einsatz in anderen Zelllinien zur Quantifizierung der Zellbewegung in Reaktion auf Reize geändert werden. Diese Methoden können Forscher, einzelne Faktoren zu identifizieren, die dazu beitragen, die Zellbewegung und bieten eine gründliche Prüfung der möglichen Mechanismen, die offensichtlichen Veränderungen der Zellmigration.
Introduction
Plazentar Entwicklung ist ein entscheidender Schritt bei der Einrichtung der Schwangerschaft Auswirkungen auf die Gesundheit von Müttern und fetalen. Allerdings ist die mechanistische Grundlage, dieser Vorgang wird, nicht vollständig verstanden. Zellmigration ist ein wichtiger biologischer Prozess, der für die Errichtung und die Funktionen der Plazenta während der Schwangerschaft beiträgt. Nach Implantation der Blastozyste unterscheidet die Trophektoderm in Zotten Trophoblasten, die bedecken die Oberfläche der Chorionzotten und Gas- und Nährstoffaustausch beteiligt sind, und extravillous Trophoblasten (EVTs), die heraus von der Zotten migrieren und dringen in die mütterliche Decidua und Gefäßsystem1. Migration von der EVTs ist essentiell für mütterliche Spirale Arterien Umbau und Einrichtung uteroplazentalen Umlauf um fetale Wachstum2zu unterstützen. Unzureichende Trophoblast Invasion während der Schwangerschaft führt zu abnormalen plazentar Entwicklung und kann dazu beitragen, Komplikationen während der Schwangerschaft wie Präeklampsie, Schwangerschafts-Hypertonie, intrauterine Wachstumsretardierung und Frühgeburt3, 4. Daher ist es wichtig zu bestimmen, die Wege für normale Einpflanzung erforderlich, Verständnis der Faktoren, die Trophoblast Motilität zu beeinflussen.
Trophoblast Migration wird durch ein komplexes Netzwerk von Signalmoleküle, einschließlich angiogenen Faktoren5, Wachstumsfaktoren, Zytokine und Hormone gesteuert. Aufgrund der Einschränkungen des Studiums der Plazenta in-vivo verewigt in-vitro-Untersuchungen mit menschlichen Trophoblast Zellen Linien wurden entscheidend zur Identifizierung von Faktoren, die zu Trophoblast Motilität. Kratzer und Invasion Assays wurden ausgiebig zur quantitativ bewerten die Rolle einzelner Moleküle am Trophoblast Zelle Migration6,7,8. Jedoch während nützlich im Tandem zu untersuchen, wie Änderungen in der Migration durch Änderungen in Zelle Invasivität verursacht werden können, erklären diese beiden Tests nicht zusätzliche Mechanismen, die zu veränderten Zellwanderung beitragen können. Senkung der Rate der Zellproliferation können beispielsweise weniger Zellen zur Migration führen.
Hier beschreiben wir quantitative in-vitro-Methoden zur Bewertung der Trophoblast Migration mit Scratch, Zellproliferation und Zelle Invasion Assays. In der Scratch-Test eine einheitliche Wunde entsteht in einer Zelle monomolekularen Film, und die Wanderung von Zellen, die Lücke durch automatisierte, Time-Lapse Bildgebung der Wunde Größe und Dichte der Zellen in der Wunde gemessen. Die Zelle Verbreitung Assay basiert auf das Verhältnis von Zellen zu jedem Zeitpunkt im Vergleich zu einer bekannten Ausgangspunkt Menge von Zellen berechnen. In der Zelle Invasion Assay Zellen sind auf eine extrazelluläre Matrix-beschichtete Zelle Kultur einfügen Kammer (z.B. Transwell) gesät, und die Anzahl der Zellen, die durch die extrazelluläre Matrix als Reaktion auf die Chemo-Lockstoff eindringen werden gezählt.
Der Scratch-Test ist ein einfaches und effektives Werkzeug, das verwendet wird, um festzustellen, wie die verschiedenen Umweltbedingungen beeinflussen Zellmigration. Die Proliferation und Invasion Assays können anschließend verwendet werden, um den Beitrag der Zellproliferation und Invasivität zu allgemeinen Änderungen in Zelle Migration zu bestimmen. Zusammen bieten diese Assays robuste Messungen der biologischen Prozesse, die zur Zelle Motilität beitragen können. Zwei verewigt Ersttrimester-Trophoblast Zelllinien wurden im beschriebenen Assays, Swan.71 (Sw.71) und HTR-8/SVneo9,10verwendet. Allerdings können diese Tests auch für den Einsatz in anderen Zelltypen, wichtige Modulatoren der Zelle Migration und Invasion zu identifizieren optimiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Verfahren stützt sich auf die Verwendung von Migration und Invasion Assays um die Rate der Zellproliferation als möglicher Beitrag zum gemessenen Unterschiede in der Trophoblast Zellbewegung erweitert. Diese in-vitro-Untersuchungen sind zusammen verwendet werden, einfache und effektive Methoden, die verwendet werden können, um die zelluläre Signalwege zu identifizieren, die Trophoblast Migration zu regulieren. Wie oben beschrieben, können Trophoblast Zellen Hormone, Zytokine, Wachstumsfaktoren oder andere Mol…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Gil Mor für die Bereitstellung der Sw.71 Zellen. Diese Forschung wurde durch eine Albert McKern Scholar Award, S.W unterstützt.
Materials
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
Referencias
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