シアログリカンの代謝標識による原発神経幹および前駆細胞の細胞表面マーカーの同定
Summary
ここでは、インビトロ神経内皮共培養システムと、一次神経幹および前駆細胞を拡張し、その表面に標識するバイオオルトホグナル機能基を持つシアログリカンの代謝組み込みを組み合わせたプロトコルです。細胞表面マーカーのイメージングまたは質量分析分析のためのサイアログリコタンパク質。
Abstract
神経幹および前駆細胞(NSPC)は、脳の複雑な構造と機能の細胞基盤である。それらは生体内の専門のニッチに位置し、インビトロで単離および拡大することができ、脳損傷を修復するための細胞移植のための重要なリソースとして機能する。しかし、NSPCは不均一であり、分子レベルで明確に定義されていないか、特定の細胞表面マーカーの欠如のために精製される。以前に報告されたプロトコルは、神経内皮共培養システムと代謝グリカン標識法を組み合わせて、一次NSPCの表面シアログリコプロテオームを同定する。NSPC-内皮共培養システムは、インビトロでの一次NSPCの自己更新と拡張を可能にし、十分な数のNSPCを生成する。バイオオルトオショナル機能群。神経培養を分化する内皮共培養で拡張された自己更新型NCSPCのシアログリーコプロテオームを比較することにより、NSPCに富む膜タンパク質のリストを同定する。詳細には、プロトコルが含まれます:1)NSPC-内皮共培養およびNSPC分化培養のセットアップ;2)O-アセチル酸当たりのアジド糖を標識するN-アジドアセチルマンノサミン(Ac4ManNAz);そして3)ビオチン結合は、質量分析のための神経培養または神経培養からのタンパク質抽出の固定後のイメージングのための改変シアログリカンに対する。次いで、NSPC富化表面マーカー候補は、拡大されたNSPCと分化された神経培養の両方から質量分析データの比較分析によって選択される。このプロトコルは、出発物質中の低い豊富な膜タンパク質を同定するために非常に敏感であり、適切な修飾を有する他のシステムにおけるマーカー発見に適用することができる
Introduction
神経幹細胞は、幹細胞プールを維持し、ニューロンとグリアに分化するために自己更新することができる多能性細胞集団として定義されています。それらは神経系の主要な細胞型であり、病気および傷ついた脳への細胞移植を通じて再生医療に大きな治療の可能性を提供するかもしれない1、2。発達が進むにつれて、神経幹細胞集団は異種3、4となり、脳内の神経幹細胞の割合は徐々に5に減少する。一般的に言えば、胚性神経幹細胞および他の神経前駆細胞は、総称して神経幹および前駆細胞(NSPC)と呼ばれ、マウス6の胚ゾーン、心室ゾーン、および心室下ゾーンに位置する。胚性脳では、神経幹細胞は中間前駆細胞(IPC)を介して直接的または間接的にニューロンを生成し、一部の種では外室ゾーン前駆体(oRGs)7、8を介して生成する。特定の分子シグネチャ、形態、幹細胞ニッチにおける位置、および分化電位はすべて、脳器形成および臨床応用における各サブタイプの役割を決定する9。ただし、現在利用可能なセル サーフェス マーカーは、異なるサブタイプの NSPC を明確に区別および浄化することはできず、これらのサブタイプの理解と使用率を制限します。
プライマリ NSPC サーフェス マーカーの識別は、3 つの主要なハードルによって制限されます。1つ目は組織内のNCSPCの細胞数が限られているため、一般的な質量分析分析用の細胞表面タンパク質サンプルの調製が困難です。第2の制限は、サブタイプ特異的な膜タンパク質データを生成するための純粋な細胞サブタイプを生成する難しさです。最後に、第3の課題は、全細胞タンパク質中の細胞表面タンパク質の低比率であり、質量分析による検出感度を阻害します。
これらの問題を克服するために、シアロジリコタンパク質10を代謝的に標識することにより、一次NSPCにおける細胞表面タンパク質を選択的に濃縮し同定する化学タンパク質アプローチを開発した。十分な数のNSPCを生成するために、我々は、透過性支持体を使用してマウス脳内皮細胞株とNSPCを共培養することにより、インビトロの未分化状態における原発性胚性NSPCを拡張および維持するために確立されたプロトコルを利用した。マトリックスインサート(例えば、トランスウェル)システム11.対照的に、NPSCは内皮細胞を持たずに単独で培養し、分化した子孫11、12を生成する。したがって、これら2つの培養システムからのタンパク質サンプルを比較分析して、NCPCと分化ニューロンで分別的に発現するタンパク質を同定することができる。ほとんどの細胞表面タンパク質は、シアル酸13によって修飾されているように、非天然シアル酸前駆体アナログN-アジドアセチルマンノサミン-四面体化(Ac4ManNAz)は、内因性、新たに内因性を持つ固有の代謝経路をハイジャックするために使用された合成されたシアログリカンは、アジド基で標識され、化学ハンドル14を生成する。シオチンをシアロジカンに結合させるアジドアルキン媒介性バイオオルトゴン反応を通じて、細胞表面タンパク質は、ストレプトアビジン結合フッ素またはマトリックス14を介してプロテオミクス同定のために可視化および濃縮することができる。
ここでは、非共培養系における内皮共培養および分化細胞において拡大したNCから表面シアログリコプロテオームのSDS-PAGEゲル解析の染色を行う。我々はまた、プロテオミック比較のための2つの培養系における表面シアロジコプロテオームを選択的に精製する。当社のプロトコルは、従来の遠心分離ベースの細胞表面浄化プロトコル15と比較して、特定のタグ結合と親和性を介して表面タンパク質抽出手順を減らすことによって抽出の有効性を高めます。浄化。一方、シアルリル化は主に細胞表面タンパク質で起こることを前提に、細胞表面タンパク質の抽出純度を高めます。内皮因子は拡大されたNSPCの分化を完全に妨げることはできませんが、共培養と分化培養との比較研究は、幹細胞を含有する表面タンパク質を必要とせずに特定する便利な方法を提供します。FACS16によって精製されたNPCからのタンパク質を分析する。このアプローチは、適切な改変を伴う他のシステムにおける表面タンパク質の研究に応用できると考えています。
Protocol
Representative Results
Discussion
表面マーカーは、一般的にインビトロおよびインビボ17、18で特定の細胞タイプにラベルを付け、精製するために使用されます。表面マーカーの発見は、正常または病理学的組織や培養皿から幹細胞集団を選択的に濃縮する分子ツールを提供することにより、再生医療や幹細胞研究に大きく貢献し、精製細胞を提供します。臨床使用または生物学的?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
図1B、1C、1E、1Fを白から再現他の.10歳英国王立化学会の許可を受けて私たちは、フィギュア編集のためのX.C.の研究室でYi Haoに感謝します。この研究は、中国国家自然科学財団(第91753206号からQ.S.およびX.C.、第31371093号からQ.S.、および第21425204号および第21672013号からX.C.まで)によって支援されています。
Materials
| BEND3 | ATCC | CRL-229 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 1% |
| Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | 1% |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 1 to 100 |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A7250 | 1 mM |
| Papain | Worthington | LS003726 | 10 U/mL |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | 1 to 50 |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| basic Fibroblast growth factor | Gibco | PHG0261 | 10 ng/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 1% |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | 10% |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| Tripsin-EDTA, 0.25% | Gibco | 25200056 | |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Transwell | Corning | 3450 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Sucrose | Sangon | A100335 | |
| DAPI | Gibco | 62248 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| SDS-PAGE loading buffer 2X | Solarbio | P1018 | |
| 6-well plate | Corning | 3335 | |
| Tris-Glycine protein gel | invitrogen | xp00100box | |
| mouse monoclonal anti-Nestin | Developmental Study Hybridoma Bank | Rat-401 | 1 to 20 |
| mouse monoclonal anti-beta-tubulin III | Sigma | T8860 | 1 to 1000 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 | invitrogen | A-21121 | 1 to 1000 |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b | invitrogen | A-21143 | 1 to 1000 |
| Albumin Bovine V | Amresco | 0332 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Brij97 | Aladdin | B129088 | |
| CuSO4 | Sigma | 209198 | |
| alkyne-biotin | Click Chemistry Tools | TA105 | |
| BTTAA | Click Chemistry Tools | 1236 | |
| Ac4ManNAz | Click Chemistry Tools | 1084 | 100 µM |
| 9AzSia | synthesized in lab | ||
| sodium ascorbate | Sigma | A4034 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| EDTA | Sangon | A100322 | |
| NaCl | Sangon | A100241 | |
| SDS | Sangon | A100227 | |
| Alexa Flour 647-conjugated streptavidin | invitrogen | S21374 | 1 to 1000 |
| Triethanolamine | Sigma | V900257 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | invitrogen | 60210 | |
| ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Thermo Scientific | 20278 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co. | 970-00026-00 | |
| DNase I | Sigma | DN25 | 12 µg/mL |
| urea | Sigma | U5378 |
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