Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor een algemene pulse-chase-methode, waarmee de kinetische analyse van vouwing, vervoer en afbraak van eiwitten te volgen in levende cellen.
Abstract
Puls-chase radioactieve labeling is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de conformationele rijping, het vervoer naar hun functionele cellulaire locatie, en de afbraak van doel proteïnen in levende cellen. Met behulp van korte (puls) radiolabeling keer (< 30 min) en streng gecontroleerd chase tijden, is het mogelijk om slechts een klein deel van de totale proteïne-pool label en volg de vouwen. Wanneer gecombineerd met nonreducing/vermindering van de Elektroforese van het gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) en immunoprecipitation met (conformatie-specifieke) antilichamen, kan vouwen processen worden onderzocht in groot detail. Dit systeem is gebruikt om te analyseren de vouwing van eiwitten met een enorme variatie in eigenschappen zoals oplosbare eiwitten, enkele en Multi-Pass transmembraan eiwitten, zwaar N – en O-geglycosyleerde eiwitten en proteïnen met en zonder uitgebreide bisulfide verlijmen. Puls-chase methoden vormen de basis van kinetische studies naar een aantal extra functies, waaronder co – en posttranslationele modificaties oligomerisatie en polymerisatie, waardoor in wezen de analyse van een eiwit vanaf de geboorte tot de dood. Puls-chase studies over de vouwing van eiwitten zijn complementair met andere biochemische en Biofysische methoden voor studeren eiwitten in vitro door verhoogde temporele resolutie en fysiologische informatie te bieden. De methoden zoals beschreven in dit document zijn gemakkelijk aangepast om te bestuderen de vouwen van bijna elk eiwit dat kan worden uitgedrukt in zoogdieren of insect-cel systemen.
Introduction
De vouwen van zelfs relatief eenvoudig eiwitten omvat vele verschillende opvouwbare enzymen, moleculaire chaperones en covalente wijzigingen1. Een volledige reconstructie van deze processen in vitro is praktisch onmogelijk, gezien het grote aantal verschillende componenten betrokken. Het is daarom zeer wenselijk, het bestuderen van in levende cellen waar de eiwitvouwing in vivo. Radioactieve pulse-jacht technieken blijken een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de synthese, vouwen, vervoer en afbraak van eiwitten in hun natuurlijke omgeving.
De metabole labeling van eiwitten tijdens een korte puls met 35S-geëtiketteerden methionine/cysteïne, gevolgd door een achtervolging in het ontbreken van een radioactieve label, kunt specifieke bijhouden van een bevolking van nieuw samengestelde eiwitten in de bredere cellulaire milieu. Vervolgens doel eiwitten kunnen worden geïsoleerd via immunoprecipitation en geanalyseerd via SDS-pagina of andere technieken. Voor veel eiwitten, wordt hun reis door de cel gekenmerkt door wijzigingen die zichtbaar op de SDS-pagina gel zijn. Bijvoorbeeld gaat het vervoer van geglycosyleerde eiwitten uit het endoplasmatisch reticulum (ER) naar het Golgi-complex vaak gepaard met wijzigingen van N-gebonden glycanen of de toevoeging van O-gebonden glycanen2,3. Deze wijzigingen veroorzaken grote stijgingen in de schijnbare moleculaire massa, die kan worden gezien door mobiliteit veranderingen in SDS-pagina. Rijping kan ook worden gemarkeerd door Proteolytische breuklijnen, zoals de signaal-peptide decollete of de verwijdering van pro-peptides, wat resulteert in veranderingen in de schijnbare moleculaire massa die kan gemakkelijk worden gevolgd op SDS-pagina gel4. Radioactiviteit heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van vergelijkbare technieken zoals cycloheximide achtervolgingen, waar nieuwe eiwitsynthese wordt voorkomen, zoals langere behandelingen giftig voor de cellen zijn en sluit niet de meerderheid van de oudere, steady-state eiwitten uit de analyse, zoals sommige eiwitten hebben half-leven van dagen. De vergelijking van eiwitten onder beide nonreducing en vermindering van de voorwaarden kan de analyse van de vorming van de bond van bisulfide, een belangrijke stap in de vouwen van vele secretoire eiwitten4,5,6, 7.
Hier beschrijven we een algemene methode voor de analyse van de vouwing van eiwitten en vervoer in onbeschadigde cellen, met behulp van een radioactief pulse-chase-aanpak. Terwijl wij hebben gericht op de methode als gedetailleerd mogelijk, het protocol heeft een bijna onbegrensde mogelijkheden voor aanpassingsvermogen en optimalisatie te bestuderen van specifieke proteïnen van elke lezer zal toestaan.
Twee alternatieve pulse-chase protocollen, één voor Adherente cellen (stap 1.1 van het hier gepresenteerde protocol) en één voor schorsing cellen (stap 1.2 van het hier gepresenteerde protocol) worden verstrekt. De voorwaarden bedoeld hier volstaan om te visualiseren een eiwit uitgedrukt met middellange – tot hoog-expressie niveaus. Als de lezer met slecht uitgedrukte proteïnen of verschillende posttreatment omstandigheden, zoals meerdere immunoprecipitations werkt, is het noodzakelijk om te verhogen van de grootte van de schotel of cel nummer op de juiste manier.
Voor schorsing pulse chase, worden de chase-monsters op elk punt van de tijd genomen uit een enkele buis van cellen. De stappen wassen nadat de pols worden weggelaten; in plaats daarvan wordt verdere integratie van 35S verhinderd door verdunning met een hoge overmaat van labelloze methionine en cysteïne.
De gepresenteerde protocollen gebruiken radioactieve 35S-geëtiketteerden cysteïne en methionine te volgen van cellulaire eiwitvouwing processen. Alle bewerkingen met radioactieve reagentia moeten worden uitgevoerd met behulp van passende beschermende maatregelen om te minimaliseren van eventuele blootstelling van de exploitant en het milieu aan radioactieve straling en worden uitgevoerd in een aangewezen laboratorium. Als de puls-chase labeling techniek is relatief inefficiënt korte puls tijde (< 15 min), minder dan 1% van het beginbedrag van radioactiviteit is verwerkt in de onlangs samengestelde eiwitten. Na de verrijking van de target eiwit via immunoprecipitation bevat het monster voor SDS-pagina minder dan 0,05 procent van het beginbedrag van radioactiviteit.
Hoewel de 35S methionine en cysteïne labeling mix is gestabiliseerd, zal sommige ontleding, opbrengst van de vluchtige radioactieve stoffen, plaatsvinden. Ter bescherming van de onderzoeker en de apparatuur, moeten sommige voorzorgsmaatregelen worden genomen. De onderzoeker moet altijd de veiligheidsvoorschriften van de lokale straling gehoorzamen en een houtskool masker, naast een laboratoriumjas en (dubbele) handschoenen van de verpleegkunde mag dragen. Voorraad flesjes met 35S methionine en cysteïne moeten altijd worden geopend in een zuurkast of onder een lokale aspiratie-punt. Bekende laboratorium besmetting plekken zijn centrifuges, pipetten, waterbaden, incubatoren en shakers. De besmetting van deze gebieden wordt verminderd door het gebruik van de pipet tips met een houtskool filter, positief-seal microcentrifuge buizen (Zie Tabel of Materials), aquarium houtskool sponzen in water baden, houtskool filtreerpapier gelijmd in de puls-chase gerechten, houtskool bewaker in de aspiratie systeem, en de plaatsing van gerechten met houtskool korrels in voorbroeders en opslagtanks.
Protocol
Representative Results
Discussion
Puls-chase methoden zijn essentieel voor de ontwikkeling van wetenschappers inzicht in waar de eiwitvouwing in onbeschadigde cellen. Terwijl wij hebben geprobeerd om te verstrekken een methode die is zo algemeen mogelijk, heeft deze aanpak het potentieel voor bijna onbegrensd variaties om verschillende processen die zich voordoen tijdens het vouwen, het vervoer, en het leven van proteïnen in de cel te bestuderen.
Bij het uitvoeren van een puls-achtervolging aanhangend cuvetten in gerechten, i…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken alle leden van de Braakman lab, verleden en presenteren, voor hun vruchtbare discussies en helpen bij de ontwikkeling van de methoden in dit artikel wordt gepresenteerd. Dit project heeft financiering ontvangen van zowel de Europese Onderzoeksraad onder de Europese Unie zevendekaderprogramma (KP7/2007-2013) N ° 235649 en de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO) onder het ECHO-programma N ° 711.012.008.
Materials
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20×25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4˚C |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
Referencias
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
- Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
- Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067 (2017).
- Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
- Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
- Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).
- Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
- Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
- Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
- Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
- Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
- Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).
