ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס
Summary
כאן נתאר פרוטוקול עבור שיטה כללית. צ’ייס הדופק המאפשר ניתוח קינטי של קיפול, תחבורה, והשפלה של חלבונים להיות בעקבות בתאים חיים.
Abstract
תיוג רדיואקטיבי. צ’ייס הדופק הוא כלי רב עוצמה עבור הלומדים ההבשלה הסתגלותי, התעבורה מיקומם הסלולר פונקציונלי, ההשפלה של היעד חלבונים בתאים חיים. באמצעות לזמנים קצרים (פעימה) radiolabeling (< 30 דקות) ומבוקר בחוזקה פעמים צ'ייס, זה אפשרי תווית רק חלק קטן של הבריכה הכולל חלבון ולעקוב אחרי הקיפול שלה. בשילוב עם nonreducing/הפחתת מרחביות-לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד), immunoprecipitation עם נוגדנים (קונפורמציה-ספציפי), קיפול תהליכים אפשר לבחון בפירוט רב. במערכת זו נעשה שימוש כדי לנתח את קיפול חלבונים עם וריאציה ענק מאפיינים כגון חלבונים מסיסים, חלבונים transmembrane יחיד, מרובה עוברים, בכבדות N O glycosylated חלבונים, חלבונים עם ובלי דיסולפידי נרחב מליטה. . צ'ייס הדופק שיטות הן הבסיס של לימודי קינטית לתוך מגוון של תכונות נוספות, לרבות co – שינויים posttranslational, oligomerization ואת פלמור, בעיקרו של דבר המאפשר הניתוח של חלבון מלידה למוות. . צ'ייס הדופק מחקרים על קיפול חלבונים הם משלימים עם שיטות אחרות הביוכימי, biophysical ללמוד חלבונים במבחנה על ידי מתן רזולוציה טמפורלית מוגברת אינפורמציה פיזיולוגית. השיטות כפי שמתואר בתוך הנייר הזה מותאמים בקלות ללמוד קיפול של כמעט כל חלבון זה יכול לבוא לידי ביטוי במערכות יונקים או חרק-cell.
Introduction
קיפול של אפילו יחסית פשוטה חלבונים כרוך השונות מתקפלים אנזימים רבים, מלווים מולקולרית ו שינויים קוולנטיות1. שיחזור מלא של אלה תהליכים במבחנה הוא בלתי אפשרי כמעט, בהתחשב ומספר עצום של מרכיבים שונים המעורבים. לכן, רצוי מאוד, ללמוד חלבון מתקפל ויוו, בתאים חיים. טכניקות רדיואקטיבי. צ’ייס הדופק להוכיח כלי רב עוצמה עבור הלומדים את סינתזה, קיפול, תחבורה, והשפלה של חלבונים בסביבתם הטבעית.
חילוף החומרים תיוג של חלבונים במהלך דופק קצר עם 35התווית על-ידי S מתיונין/ציסטאין, ואחריו מרדף בהיעדר תווית רדיואקטיבי, מאפשר מעקב מסוים של אוכלוסייה של חלבונים לאחרונה מסונתז ב חצרו הסלולר רחב יותר. לאחר מכן, חלבונים היעד יכול להיות מבודדים באמצעות immunoprecipitation, נותחו באמצעות מרחביות-עמוד או בטכניקות אחרות. חלבונים רבים, המסע שלהם דרך התא מסומן על-ידי שינויים הנראים לעין על ג’ל מרחביות-דף. לדוגמה, העברת מהחלבונים glycosylated תוך-פלזמית (ER) למתחם גולג’י לעיתים קרובות מלווה שינויים של glycans מקושרים-N או התוספת של2,O מקושרים glycans3. שינויים אלה גורמות גדול לעלייה המסה המולקולרית לכאורה, אשר ניתן לראות על ידי ניידות שינויים בדף-מרחביות. ההבשלה יכולים גם להיות מסומנים על ידי אדמירל הפרוטאוליטי, כגון אות-פפטיד מחשוף או ההסרה של pro-פפטידים, וכתוצאה מכך שינוי המסה המולקולרית לכאורה ניתן בעקבות בקלות על ג’ל מרחביות-דף4. רדיואקטיביות יש יתרונות ניכר על טכניקות דומות כגון cycloheximide רודף, איפה סינתזה של חלבון הרומן מנועה, כמו טיפולי ארוך רעילים לתאים, אינה שוללת את הרוב המכריע של מבוגר, מצב יציב מהחלבונים ניתוח, כמו כמה חלבונים יש מחצית החיים של ימים. ההשוואה של חלבונים תחת שניהם nonreducing הפחתת התנאים מאפשר הניתוח של היווצרות קשר דיסולפידי, צעד חשוב בקיפול של הרבה חלבונים הפרשה4,5,6, 7.
כאן אנו מתארים שיטה כללית לניתוח של קיפול חלבונים ותעבורה תאים שלמים, תוך שימוש בגישה רדיואקטיבי. צ’ייס דופק. בעוד אנחנו כיוונת לספק שיטת כמו מפורט ככל האפשר, הפרוטוקול פוטנציאלי כמעט בלתי מוגבלת של הסתגלות ויאפשר אופטימיזציה ללמוד חלבונים ספציפיים של כל קורא.
שני פרוטוקולים הדופק חלופי-צ’ייס, אחד עבור תאים חסיד (שלב 1.1 של פרוטוקול המובאת כאן) ואחד עבור השעיה תאים (שלב 1.2 של פרוטוקול המובאת כאן) הינם מסופקים. התנאים הניתנים כאן מספיקים להמחיש חלבון שבאה לידי ביטוי עם רמות בינונית-גבוהה הביטוי. אם הקורא הוא עובד עם חלבונים ביטוי לקוי או תנאים posttreatment שונים, כגון immunoprecipitations מרובות, זה הכרחי להגדיל את גודל המנה או הנייד שלי כראוי.
לצ’ייס הדופק ההשעיה, הדגימות צ’ייס שצולמו לכל נקודת זמן כל לקוחים מתוך שפופרת אחת של תאים. השלבים לשטוף אחרי הדופק מושמטים; במקום זאת, בהמשך תיאגוד 35S נמנעת באמצעות דילול עם עודף גבוה של מתיונין ללא תווית, ציסטאין.
הפרוטוקולים הציג להשתמש רדיואקטיבי 35התווית על-ידי S ציסטאין ומתיונין לעקוב אחר תהליכים קיפול חלבונים תאיים. כל הפעולות עם ריאגנטים רדיואקטיבי צריכה להתבצע באמצעות אמצעי הגנה מתאימים כדי למזער כל חשיפה של המפעיל לבין הסביבה לקרינה רדיואקטיבית, ניתן לבצע בתוך מעבדה ייעודית. . המרדף הדופק תיוג טכניקה הוא יעיל יחסית בזמנים קצרים הדופק (< 15 דקות), פחות מ 1% מהסכום ההתחלתי של רדיואקטיביות מעוגנת את החלבונים עתה מסונתז. לאחר העשרת של חלבון המטרה באמצעות immunoprecipitation, המדגם מרחביות-דף מכיל פחות מ- 0.05% מהסכום ההתחלתי של רדיואקטיביות.
למרות מתיונין 35S של ציסטאין תיוג מיקס מתייצב, כמה ריקבון, מניב רדיואקטיבי תרכובות נדיפות, תתרחש. כדי להגן על החוקר, את המנגנון, כמה אמצעי זהירות יש לנקוט. החוקר תמיד צריך לציית? לחוקים בטיחות קרינה מקומית, ניתן ללבוש של פחם סיעוד מסכה, מלבד חלוק מעבדה וכפפות (זוגי). מניות צלוחיות עם 35S מתיונין, ציסטאין תמיד אמור להיפתח בשכונה fume, או תחת נקודת שאיפה מקומיים. מעבדה ידוע זיהום שהנקודות צנטריפוגות, פיפטות, מרחצאות מים, חממות, ומנענעים. הזיהום של אזורים אלה מצטמצם באמצעות פיפטה טיפים עם מסנן פחם, צינורות microcentrifuge חיובי-חותם (ראה טבלה של חומרים), אקווריום פחם ספוגים מים אמבטיות, פחם מסנן עיתונים מודבקים את הכלים. צ’ייס דופק, פחם משמר מערכת השאיפה, ואת המיקום של מאכלים המכילים גרגרים פחם חממות, מיכלי אחסון.
Protocol
Representative Results
Discussion
. צ’ייס הדופק שיטות היו חיוניים לפיתוח הבנה המדענים של חלבון מתקפל לתוך תאים שלמים. ניסינו לספק שיטה זה כמו כללי ככל האפשר, גישה זו יש הפוטנציאל של וריאציות כמעט בלתי מוגבלת ללמוד תהליכים שונים המתרחשים בזמן קיפול, את התחבורה ואת החיים של חלבונים בתוך התא.
בעת ביצוע מרדף הדופ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה לכל החברים של המעבדה Braakman, מעבר, להציג, דיונים פוריים שלהם ולעזור בפיתוח שיטות שהוצגו במאמר זה. הפרויקט קיבל מימון של המועצה האירופית למחקר תחת של האיחוד האירופי תכנית המסגרת השביעית (האיחוד FP7/2007-2013) N ° 235649 והן הולנד הארגון של מדעי למחקר (בתחרות) תחת אקו-תוכנית N ° 711.012.008.
Materials
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20×25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4˚C |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
Referencias
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
- Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
- Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067 (2017).
- Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
- Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
- Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).
- Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
- Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
- Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
- Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
- Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
- Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).
