בידוד של רקמות עובריים ועל היווצרות האיברים Chimeric שליו-עוף לפי הדוגמה בלוטת התימוס
Summary
מאמר זה מספק שיטה לבודד טהור עובריים רקמות מעוברים שליו ועוף שניתן לשלבם לטופס ex-vivo האיברים chimeric.
Abstract
היכולת לבודד את רקמות עובריים היה צעד חיוני להקמת המערכת כמירה שליו-עוף, אשר בתורו סיפקה תרומות ללא עוררין חשיפת תהליכים מרכזיים בביולוגיה התפתחותית.
בזאת הוא תיאר שיטה ממוטבת כדי לבודד עובריים רקמות שליו ותרנגולות למיקרו, עיכול אנזימטי תוך שמירה על המאפיינים הביולוגיים שלו. לאחר בידוד, רקמות בשני המינים קשורים בשום וזמינותו organotypic במבחנה עבור 48 ה שליו, עוף רקמות ניתן שיפלו על ידי נפרדים תכונות גרעיניות סמנים מולקולריים המאפשר חקר הסלולר צולבות לדבר בין האגודה heterospecific של רקמות. גישה זו היא, אפוא, כלי שימושי עבור לימוד אינטראקציות רקמות מורכבות בתהליכים התפתחותיים עם השינויים מרחבי דינמי מאוד, כגון אלה המתרחשים במהלך מורפוגנזה לועי ואת היווצרות במעי הקדמי נגזר האנדודרם איברים. בגישה ניסויית זו פותחה לראשונה כדי לחקור את האינטראקציות אפיתל mesenchymal במהלך השלבים המוקדמים של היווצרות בלוטת התימוס. בחודש זה, נגזר האנדודרם rudiment הרתי פוטנציאליים, נגזר והמזודרם מזנכימה, הם בודדו אותנו מהמתרחש עוברי שליו ועוף, בהתאמה.
הקיבולת של הרקמות הקשורים להפקת איברים יכול להיבדק עוד יותר על ידי הרכבה אותם על גבי קרום chorioallantoic (CAM) של העובר עוף. מצלמת מספק חומרים מזינים ומאפשרת חילופי גז הרקמות explanted. לאחר 10 ימים בפיתוח ovo, ניתן לנתח את האיברים chimeric ב explants שנקטפו על ידי שיטות קונבנציונליות מורפולוגי. הליך זה מאפשר גם לומד רקמות ספציפיות תרומות במהלך היווצרות האיברים, של התפתחותו הראשונית (פיתוח במבחנה) בשלבים האחרונים של organogenesis (בשלבי פיתוח ovo).
לבסוף, שיטת בידוד משופר מספק גם three-dimensionally (3D) לשימור רקמות עובריים, יכול לשמש גם לניתוח הטופוגרפי ברזולוציה גבוהה של דפוסי ביטוי גנים של רקמות ספציפיות.
Introduction
בשנות השבעים המוקדמות, מערכת אלגנטיות תרנגולת-שליו כמירה פותחה על ידי Le Douarin, פתיחת דרכים חדשות כדי להבין את התפקיד של נדידת תאים אינטראקציות סלולרי במהלך פיתוח1,2. המודל הומצאה על ההנחה כי התא החליפין בין שני המינים לא כן משמעותית מופרה, מאוחר יותר מאושרת כאשר חקר תהליכים התפתחותיים רבים, כולל הקמת לחוצה, את hematopoietic מערכות1. לוקחים שהאחרון כדוגמה, הגלים מחזורית של אבות hematopoietic colonizing תחילתו אפיתל הרתי קודם נצפתה באמצעות מערכת כמירה שליו-עוף3. בשביל זה, הטריטוריה פוטנציאליים של בלוטת התימוס, האנדודרם של השיטה השלישית, הרביעית בלוע (3/4PP), היה, enzymatically מבודדים מעוברים שליו (q) בשלב 15 עד 30 – somite [היום עובריים (E) 1.5-E2.5]. שלבים אלה תואמות המבורגר ועוף המילטון4 (HH) – שלבים 12-17. ההליכים בידוד התחיל עם השימוש של טריפסין מביצועם enzymatically את האנדודרם מ מזנכימה המצורפת. האנדודרם מבודד היה הושתל לתוך האזור somatopleura של העובר עוף (c) מארח ב- E3-E3.5 (HH-שלבים 20-21). מזנכימה heterologous זה נחשב “מתירניות” להתפתחות אפיתל הרתי לתרום גם היווצרות האיברים3. לאחר מכן, גלים רצופים של עוף מארח נישא בדם ובתאים הסתננו שליו התורמת הרתי אפיתל המקביל לו לתרום התימוס היווצרות העובר מארח3.
לאחרונה, גירסה שונה של גישה זו גם הוכח להיות חשוב ללמוד אינטראקציות אפיתל mesenchymal במהלך השלבים המוקדמים של היווצרות בלוטת התימוס5. במובן זה, הרקמות המעורבים היווצרות של בלוטת התימוס חוץ רחמי העוברים chimeric3 היו מבודדים, שניהם מעוברים התורם ואת המארח, ומקושרת ex-vivo. פרוטוקול משופרת שימש כדי לבודד את האנדודרם 3/4PP שליו (E2.5-E3) ווהמזודרם somatopleura את העוף (E2.5-E3). בקצרה, רקמות עובריים היו מבודדים על ידי תיאום ובכפוף במבחנה pancreatin עיכול. כמו כן, התנאים של עיכול אנזימטי, טמפרטורה וזמן של דגירה אופטימציה על פי סוג הרקמה שלב התפתחותי (טבלה 1).
בשלב הבא, הרקמות מבודד היו משויך של organotypic במערכת חוץ גופית על 48 שעות, כפי שדווחה בעבר5,6. האגודה במבחנה של רקמות מחקה באינטראקציה תאית מקומי העובר, להתגבר על הגבלות מסוימות של המניפולציה ויוו. מערכת זו היא שימושית במיוחד ללמוד באינטראקציה תאית אירועים morphogenic מורכבים, כגון הפיתוח של מנגנון בלוע.
התרומה של כל רקמות התימוס histogenesis, כמו גם את היכולת של האגודה heterospecific כדי להפיק התימוס יכול להיות עוד יותר בחנו באמצעות מצלמת מתודולוגיה, מפורט בעבר5,7,8. תמציתי, הרקמות בתרבית היו הושתל אל מצלמת cE8 עוברי, מותר לפתח ovo במשך 10 ימים. לאחר מכן, היווצרות בלוטת התימוס הוערך על ידי ניתוח מורפולוגי ב explants שנקטפו. כמו לימודים קלאסיים שליו-עוף3, האפיתל הרתי שליו היה התנחלו מאת hematopoietic ובתאים (HPCs) נגזר מן העובר עוף, אשר הוצגה מאוחר יותר כדי לתרום איברים פיתוח9,10 . HPCs היגרו העובר את בלוטת התימוס chimeric חוץ רחמי דרך מאוד vascularized מצלמת5,7,8. שליו אפיתל הרתי נגזר ניתן לזהות באמצעות אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים תלויי מין (קרי, QCPN – MAb שליו PeriNuclear), התגברות על הצורך של סמנים מולקולריים רקמות ספציפיות.
זו השיטה הניסיונית, כמו הגישה שני שלבים דיווחו הפרסום הקודם8, מאפשרת את האפנון של מסלולים האיתות על ידי הממשל הרגיל של סוכנים תרופתי במהלך במבחנה, בפיתוח ovo. כמו כן, ניתן לקצור explants בכל נקודת זמן הקורס של ניסוי8.
לבסוף, הבידוד פרוטוקול מפורט כאן מאפשר השימור של מאפיינים טבעיים 3D-ארכיטקטורה של רקמות עובריים, שימושי במיוחד עבור המפרט את דפוסי ביטוי גנים באתרו של השטחים עובריים אחרת נגיש על ידי שיטות קונבנציונליות. בנוסף, גישות ניתוח transcriptome, כולל ה-RNA-seq או מיקרו-מערכים, ניתן להחיל גם ברקמות מבודדת ללא צורך גנטיים תוך מתן ניתוח “טכנולוגיות” תפוקה גבוהה רקמות ספציפיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההליך בידוד מתחלקים מפורט כאן היה חל שיפור טכניקות הקודם כדי לייצר עוברי תרנגולת-שליו chimeric הקשרים ביולוגיים שונים-3,–5,–6.
גישה זו מתאימה לבודד רקמות עובריים טהור ללא צורך מניפולציה גנטית או השימוש של רקמות ספציפיות סמנים, של…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים על איזבל Alcobia על קריאה ביקורתית של כתב היד, מריו אפונשו הקריינות וידאו וכדי Vitor Proa מן השירות היסטולוגיה של ה-e Histologia דה אינסטיטוטו Biologia לעשות Desenvolvimento, Faculdade דה רפואה de Lisboa. Universidade de Lisboa, לקבלת תמיכה טכנית. אנחנו חבים במיוחד פאולו Caeiro, הוגו סילבה מ Unidade דה audiovisuais (יחידת אורקולי), Faculdade דה רפואה de Lisboa, Universidade de Lisboa על מחויבותם מצטיינים לייצור של וידאו זה. אנו להכיר לייקה מיקרוסיסטמס בחביבות לספק סטריאוסקופ מצויד עם מערכת וידאו, כדי Interaves – שימור אורח אגרו-Pecuária, s. A משתמשינו שליו מופרית ביצים. עבודה זו נתמכה על ידי דה Faculdade רפואה de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
Referencias
- Le Douarin, N. The Nogent Institute–50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Biología del desarrollo. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio–mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Biología del desarrollo. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Biología del desarrollo. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
