Изоляция эмбриональных тканей и формирование химерных органов перепела курица с помощью примера тимуса
Summary
Эта статья предоставляет метод для изоляции чисто эмбриональных тканей из перепелов и курица эмбрионов, которые могут быть объединены в ex vivo химерных органов.
Abstract
Способность изолировать эмбриональных тканей является важным шагом для создания системы Химера перепела курица, которая в свою очередь неоспоримый вклад в открытие ключевых процессов в биологии развития.
Здесь будет описано оптимизированный метод для изоляции эмбриональных тканей из перепелов и куры микрохирургии и ферментативного пищеварения при сохранении его биологических свойств. После изоляции тканей из обоих видов связаны в assay в пробирке organotypic за 48 ч. перепела и курица тканей могут подвергаться ядерной особенностями и молекулярных маркеров, позволяя изучение клеточных кросс беседы между неспецифический Ассоциация тканей. Таким образом, этот подход является полезным инструментом для изучения взаимодействия сложных тканей в процессы развития с высокодинамичные пространственные изменения, например тех, кто во время глоточные морфогенеза и формирование Передняя кишка эндодермы производные органы. Этот экспериментальный подход был впервые разработан для изучения эпителия мезенхимальных взаимодействий во время ранних стадиях формирования тимуса. В этом, энтодермы производные перспективных тимуса рудимент и мезодермы производных мезенхимы, были изолированы от перепела и куриного эмбриона, соответственно.
Связанные тканей способность генерировать органов может быть далее проверена путем прививки их на chorioallantoic мембрану (CAM) куриного эмбриона. CAM позволяет обмена газа в explanted ткани и питательных веществ. После 10 дней в развитии ovo химерных органы могут быть проанализированы в заготовленной эксплантов обычные Морфологические методы. Эта процедура также позволяет изучать ткани конкретных взносов во время формирования органа, от его первоначальной разработки (в лабораторных условиях развития) на заключительных этапах органогенеза (в развитии ovo).
Наконец, метод улучшения изоляции также предоставляет трехмерно (3D) сохранились эмбриональных тканей, которые могут также использоваться для высокого разрешения топографический анализ экспрессии генов ткани конкретных моделей.
Introduction
В начале 1970-х элегантный перепела курица Химера система была разработана Le Douarin, открывая новые возможности для понимания роли миграции клеток и клеточных взаимодействия во время разработки1,2. Модель была разработана исходя из того, что клетки обмен между двумя видами не будет значительно нарушить эмбриогенеза, позднее подтвердили, когда используется для изучения многочисленных процессов развития, включая формирование нервной и Кроветворная системы1. Принимая последний, как например, циклические гемопоэтических прародителей, колонизируя тимуса эпителиальные рудимент был впервые наблюдать волны с помощью системы перепела курица Химера3. Для этого перспективные территории тимуса, энтодермы третий и четвертый глоточные Чехлы (3/4PP), был механически и ферментативно изолирован от перепела (q) эмбрионов на 15-30 – Сомит стадии [1,5 E2.5 эмбриональных день (E)]. Эти этапы соответствуют куриный гамбургер и Хэмилтон4 (HH) – 12-17 этапов. Процедуры изоляции началась с использованием трипсина ферментативно не присоединяться энтодермы от прилагаемый мезенхимы. Изолированные энтодермы был привитые в регионе somatopleura эмбриона курицы (c) разместить на E3-E3.5 (HH-этапы 20-21). Этот гетерологичных Мезенхима считался «разрешительный» для развития тимуса эпителия, также способствующих формирования органа3. Потом последовательные волны Куриные хост кровь прогениторных клеток проникли перепелиные доноров тимуса эпителиальные двойники способствует формированию тимуса в принимающей эмбриона3.
Совсем недавно модифицированную версию этого подхода также было доказано, чтобы быть важным для изучения эпителия мезенхимальных взаимодействий во время ранних стадиях формирования тимуса5. В этом отношении ткани, участвует в формировании внематочная тимуса в эмбрионов химерных3 были изолированы, оба от доноров и принимающих эмбрионы и связанные ex vivo. Улучшенная протокол был использован для изолировать энтодермы Перепелиные 3/4PP (E2.5-E3) и куриные somatopleura мезодермы (E2.5-E3). Вкратце эмбриональных тканей были изолированы, микрохирургии и при условии соблюдения в пробирке Панкреатин пищеварение. Кроме того условия ферментативного пищеварения, температура и время инкубации были оптимизированы по ткани типа и стадии развития (Таблица 1).
Далее изолированные тканей были связаны в organotypic в системе in vitro в течение 48 часов, как сообщалось ранее5,6. В пробирке Ассоциация тканей имитирует местной сотовой взаимодействий в эмбрион, преодолеть некоторые ограничения в естественных условиях манипуляции. Эта система особенно полезна для изучения клеточных взаимодействия в сложных морфообразующих события, такие как развитие глоточные аппарата.
Вклад каждого ткани тимуса Гистогенез, а также способность неспецифический ассоциации для создания тимуса может быть изучены с использованием методологии CAM, ранее подробные5,,78. Лаконично культивированный тканей были привитым CAM Уэ8 эмбрионов и позволило разработать в ovo на 10 дней. Затем тимус формирования была оценена морфологического анализа в заготовленной эксплантов. Как в классических исследований куриные перепелиные3перепелиные тимуса эпителия была колонизирована гемопоэтических предшественников клетки (HPCs), полученные из куриного эмбриона, который позднее был показан вносить орган развития9,10 . HPCs мигрировали из эмбриона внематочная химерных тимуса через5,высоко васкуляризированной CAM,7,,8. Перепелка, производные тимуса эпителия может быть идентифицирован иммуногистохимии, используя вегетационных антитела (т.е., QCPN – МАБ перепелиные PeriNuclear), преодоление потребность тканей конкретных молекулярных маркеров.
Этот экспериментальный метод, как сообщалось в предыдущие публикации8, двухэтапный подход позволяет модуляции сигнальных путей регулярные администрации фармакологических агентов во время в пробирке и в развитии ovo. Кроме того эксплантов могут быть собраны в любой момент времени курс эксперимент8.
И наконец Протокол изоляции здесь подробно позволяет сохранение природных свойств и 3D-архитектура эмбриональных тканей, особенно полезно для детализации структуры на местах экспрессии генов эмбриональных территорий в противном случае недоступны обычные методы. Кроме того транскриптом анализ подходов, включая РНК seq или microarrays, может также применяться в отдельных тканях не требуя генетических маркеров, обеспечивая анализ «омику» ткани конкретных высокой пропускной способности.
Protocol
Representative Results
Discussion
От предыдущих методов для создания химерных перепела куриных эмбрионах в различных биологических условиях3,5,6была улучшена процедура изоляции эмбриональных тканей, подробно здесь.
Этот подход подходит для изоляции чис…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность Изабель Alcobia для критического чтения рукописи, Марио Энрикес для видео повествования и Vitor Proa от службы гистология Instituto de Histologia e Biologia делать Desenvolvimento, прослушал де Medicina де Lisboa, Universidade de Lisboa, для технической поддержки. Мы признательны особенно Паулу Caeiro и Уго Силва из Unidade de audiovisuais (аудиовизуальных единица), прослушал де Medicina де Lisboa, Universidade de Lisboa за их выдающуюся приверженность производства этого видео. Мы признаем Leica Microsystems за любезно предоставление стереоскоп, оборудовано системой видео и для Interaves – Sociedade Агро-Pecuária, С.А. вклад с перепелиным оплодотворенных яиц. Эта работа была поддержана прослушал де Medicina де Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
Referencias
- Le Douarin, N. The Nogent Institute–50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Biología del desarrollo. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio–mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Biología del desarrollo. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Biología del desarrollo. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
