高スループットの改善された呼吸器合胞体ウイルス (RSV) 微量中和試験
Summary
本研究は、高スループットを説明します呼吸器合胞体ウイルス (RSV) の中和抗体の力価を決定するためのマイクロ中和アッセイのイメージングに基づきます。このアッセイの形式は、別のサンプル タイプにテストされています。
Abstract
呼吸器合胞体ウイルス特異中和抗体 (RSV NAbs) は、RSV に対する保護の重要なマーカーです。さまざまな分析フォーマットの数が現在使用中世界中があるので RSV NAbs を測定する正確かつ高スループット方法に必要性。RSV サブグループ A でテストされています、RSV サブグループ B の別のサンプル タイプも適合できるイメージング ベース微量中和試験をご紹介します。このメソッドは、10% 未満のものをされている参照抗測定間変動と、再現性が高いです。この試金は比較的低コストで、世界中の研究所で容易に確立できると考えています。RSV NAbs を測定、向上、高スループットの測定法の開発は、将来的に新規の RSV ワクチン候補の評価のために重要なあることと同様、国際的にこの方法の標準化のための重要な一歩前進を表します。
Introduction
呼吸器合胞体ウイルス (RSV) は、小児人口世界1の下気道感染症の主要な原因です。その高い負担にもかかわらずありませんまだワクチンや治療。2013 年以降、世界保健機関 (WHO) は回 WHO 協議会議2,の3の主要な研究の優先順位として RSV ワクチンの開発を宣言しています。WHO は、保護4の主要な血清学的マーカーと見なされると、rs ウイルス中和抗体 (NAb) の測定を使用してワクチンの免疫原性を監視するに合意しました。NAbs 抗 rs ウイルス抗体 palivizumab、現在のみ予防戦略利用できる4の臨床試験と同様、研究の数の厳しい RSV 感染に対する保護するために示されています。
5,6,7、8に挑戦の標準化の努力をした細胞および分子ベースのアッセイを含む世界中の研究所で使用される複数の NAb アッセイ フォーマットがあります。ただし、RSV 型特異抗体の存在によって減らされたプラーク形成単位 (PFU) の数を測定する従来のプラーク減少中和 (PRN) アッセイまだ金本位制9のままです。ここで、RSV の異なる系統と増加測定スループットに多数の細胞に使用ことができます改善、簡素化、および高スループット PRN プロトコルを報告します。このプロトコルは、さまざまな設定からだけでなく、動物実験からのサンプルの臨床サンプルを使用してテストされています。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々 は開発し、ほとんどの実験室に容易に合わせることができるシンプルかつ効率的なの RSV マイクロ中和のアッセイを最適化します。この試金はコンピューター化されたイメージのスキャンを使用して細胞レベルで民放連によるウイルス感染の阻害を測定し同様、ウイルスの感染能力を測定することができます。イメージング ベースのプラットフォームおよび特定抗体ベース システムの?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、関与するすべての参加者をありがとうございます。我々 は、ビクトリア朝の政府の運用インフラストラクチャ サポート プログラムを認めます。PVL は、NHMRC キャリア開発フェローシップ受領者です。
Materials
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50ml aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1X PBS for culture (stored at 4°C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22um (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5ml serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
Referencias
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
- Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. . Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
- Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
