Bir geliştirilmiş ve yüksek üretilen iş respiratuvar sinsityal virüs (RSV) mikro-nötralizasyon tahlil
Summary
Bu çalışmada açıklar yüksek işlem hacmi, nötralize antikorlar respiratuvar sinsityal virüs (RSV) için belirli titresi belirlemek için görüntüleme tabanlı mikro-nötralizasyon tahlil. Bu tahlil biçimi farklı örnek türleri üzerinde test edilmiştir.
Abstract
Solunum sinsisyal virüs özgü nötralize antikorlar (RSV yakalar) RSV karşı koruma önemli bir işaret vardır. Bu nedenle farklı tahlil biçimleri bir dizi şu anda dünya çapında bir ihtiyaç RSV yakalar ölçmek için doğru ve yüksek işlem hacmi bir yöntem için kullanılmaktadır. Biz burada RSV alt grubu A test edilmiş ve aynı zamanda RSV alt grubu B ve farklı örnek türleri için adapte edilebilir bir görüntüleme tabanlı mikro-nötralizasyon tahlil açıklayın. Bu yöntem son derece az % 10 varlık başvuru anti-serum arası tahlil varyasyon ile tekrarlanabilir. Bizce bu tahlil nispeten düşük maliyetle dünya çapında birçok laboratuarlarında kolayca kurulabilir. Gelişme RSV yakalar ölçer bir geliştirilmiş, yüksek üretilen iş testin yanı sıra roman RSV aşısı adayların değerlendirilmesi için gelecekte kritik bu yöntem Uluslararası Standardizasyon için önemli bir adım gösterir.
Introduction
Respiratuvar sinsisyal virüs (RSV) alt solunum yolu enfeksiyonları Pediatrik popülasyon dünya çapında1önde gelen nedenidir. Onun yüksek yük rağmen hala hiçbir aşı veya tedavi kullanılabilen bulunmamaktadır. 2013 yılından bu yana, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) RSV aşısı geliştirme yıllık WHO istişare toplantıları2,3ile bir büyük araştırma öncelik olarak ilan etti. WHO Bu koruma4büyük serolojik marker olarak tanınan olarak aşı immünojenisite, izlemek için antikor (NAb) ölçüm nötralize RSV kullanarak kabul etti. NAbs ağır RSV enfeksiyonu yanı sıra anti-RSV monoklonal antikor palivizumab, şu anda sadece profilaktik strateji kullanılabilir4klinik çalışmalar bir dizi karşı korumak için göstermiştir.
Birden çok NAb tahlil laboratuvarları tarafından Dünya çapında,5,6,7,8zorlu standartlaştırma çabaları yapmış hücre ve moleküler tabanlı deneyleri de dahil olmak üzere kullanılan biçimi vardır. Ancak, bir RSV özgü antikor varlığı ile sınırlı plak oluşturan birimler (PFU) sayısını ölçer geleneksel plak-azaltma nötralizasyon (PRN) tahlil hala altın standart9kalır. Burada, çok sayıda hücre satırlarında ile artan tahlil geçerek ve farklı RSV suşları için kullanılabilir bir geliştirilmiş, Basitleştirilmiş ve yüksek işlem hacmi PRN Protokolü raporu. Bu iletişim kuralı klinik numuneleri farklı ayarlar yanı sıra hayvan modeli deneyler örnekleri Tarih kullanılarak test edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz geliştirdik ve çoğu laboratuvarlarında kolayca uyarlanabilir bir basit ve etkili RSV mikro-nötralizasyon tahlil en iyi duruma getirilmiş. Bu tahlil viral enfeksiyon yeteneği hem de viral enfeksiyon NAb bilgisayarlı görüntü tarama kullanarak hücresel düzeyde tarafından inhibisyonu ölçme ölçmek yapabiliyor. Bir görüntüleme tabanlı platform ve belirli antikor tabanlı sistemler özgüllük ve geleneksel plak algılama yöntemleri6,7‘ ye gö…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar dahil tüm katılımcılara teşekkür ederim. Victoria Hükümeti’nın operasyonel altyapı destek programı anıyoruz. PVL NHMRC kariyer geliştirme bursu alıcı olduğunu.
Materials
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50ml aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1X PBS for culture (stored at 4°C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22um (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5ml serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
Referencias
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
- Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. . Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
- Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
