Xylem Распределение воды в Древесных растениях, визуализированных с крио-сканирования электронный микроскоп
Summary
Наблюдение за распределением воды в ксилеме дает важную информацию о динамике потока воды в древесных растениях. В этом исследовании мы демонстрируем практический подход к наблюдению за распределением воды ксилем на месте с помощью криостата и крио-SEM, который устраняет артефактные изменения в состоянии воды во время подготовки образца.
Abstract
Сканирующий электронный микроскоп, установленный крио-единица (крио-SEM), позволяет наблюдать за образцами при минусовых температурах и используется для изучения распределения воды в тканях растений в сочетании с методами замораживания фиксации с использованием жидкого азота (LN 2). Для древесных видов, однако, препараты для наблюдения ксилем поперечной огранки поверхности связаны с некоторыми трудностями из-за ориентации древесных волокон. Кроме того, более высокое напряжение в колонке воды в ксилемских каналах иногда может привести к артефактным изменениям в распределении воды, особенно во время фиксации и сбора проб. В этом исследовании мы демонстрируем эффективную процедуру наблюдения за распределением воды в ксилеме древесных растений на месте с помощью криостата и крио-SEM. Во-первых, во время сбора образцов, измерения потенциала воды ксилем аможет должен определить, присутствует ли высокое напряжение в ксилемских каналах. При низком потенциале ксилема воды (злот; около 0,5 МПа), процедура релаксации напряжения необходима для содействия лучшему сохранению состояния воды в ксилемских каналах во время фиксации замораживания образцов. Далее, водонепроницаемый воротник крепится вокруг ствола дерева и заполнен ы LN2 для замораживания фиксации состояния воды ксилем. После сбора урожая следует позаботиться о том, чтобы образец сохранялся замороженным при завершении процедур подготовки образца к наблюдению. Криостат используется, чтобы четко разоблачить поперечную поверхность ксилема. При крио-SEM-наблюдениях требуется корректировка времени для замораживания травления для удаления ледяной пыли и акцентирования края стенок клеток на смотровой поверхности. Наши результаты демонстрируют применимость крио-SEM методов для наблюдения распределения воды в xylem на клеточном и субклеточном уровнях. Сочетание крио-SEM с неразрушающими методами наблюдения на месте позволит значительно улучшить изучение динамики потока воды древесных растений.
Introduction
Наличие водных ресурсов (т.е. осадки, содержание воды в почве) строго определяет смертность и географическое распределение видов растений, поскольку им необходимо поглощать воду из почвы и транспортировать ее в листья для фотосинтетического производства. Растения должны поддерживать свою систему водного транспорта под колеблющимися запасами воды. В частности, древесные растения создают высокую напряженность в своих каналах вдоль транспирационных потоков, поскольку в некоторых случаях им необходимо удерживать свою корону на высоте более 100 м над землей. Для поддержания столбов воды при таком высоком отрицательном давлении ксилемные каналы состоят из континуума трубчатых клеток с жесткими и гидрофобно-лигнированными клеточными стенками1. Уязвимость ксилем дисфункции ксилем каналов в каждом виде является хорошим детерминантом выживания видов при колебаниях водоснабжения2. Кроме того, изучение водного состояния ксилемных каналов имеет важное значение для оценки состояния здоровья отдельных деревьев, подвергающихся абиотическим или биотическим стрессам. Измерение потока сока или водного потенциала может дать оценку состояния воды древесного растения в связи с интегрированной гидравлической функцией ксилемовых каналов. Кроме того, визуализация распределения воды в клетках ксилема может прояснить состояние отдельных компонентов ксилемской гидравлической системы.
Несколько методов для визуализации состояния воды ксилем каналов существуют3. Классические и полезные методы наблюдения водных путей в древесной ткани включают окрашивание водного столба путем погружения концы разрезающих ветвей в краситель или путем введения красителя в стоячие стебли деревьев4. Мягкая рентгеновская фотография также позволяет визуализировать распределение воды нарезанных деревянных дисков из-за дифференциальной интенсивности поглощения рентгеновского излучения влаги в xylem5,6. Эти методы, однако, только обеспечивают следы движения воды или демонстрируют макроскопические распределения воды. В последнее время, неразрушающие методы наблюдения, такие как микрофокус рентгеновская компьютерная томография (ККТ)7,8,9,10и магнитно-резонансная томография (МРТ)11, 12, были значительно улучшены, чтобы позволить наблюдения воды в ксилем каналов в нетронутых саженцев. Эти неразрушающие методы имеют большие преимущества в том, что мы можем наблюдать состояние воды xylem без искусственных эффектов резки, и мы можем отслеживать динамику потока воды путем последовательной визуализации или введения контрастного агента10. Тем не менее, мы должны использовать индивидуальные МРТ для визуализации растений или специализированное средство для синхротронной основе ККТ для того, чтобы получить изображения, которые могут определить содержание воды клеточного уровня. Кроме того, хотя синхротронная система ЗКТ позволила получить тонкие изображения с высоким пространственным разрешением, что сопоставимо с световой микроскопией7,8,9, живые клетки могут быть повреждены излучение высокой энергии рентген13,14. Использование сканирующего электронного микроскопа, в котором установлены крио-единицы (крио-SEM), является очень полезным методом для точного определения местонахождения воды в ксилеме на клеточном уровне, хотя для этого требуется разрушительное сбор образца для наблюдения. Для фиксации воды в ксилем-каналах часть стеблей (т.е. ветки, ветви или стебли) замораживаются наместе жидким азотом (LN 2). Наблюдения за поверхностью обрезанных, замороженных образцов крио-SEM обеспечивают высокоувеличенные изображения структуры ксилема, из которой мы можем определить воду в ксилемских каналах как лед. Существенным ограничением этого метода является то, что последовательное наблюдение за подвижностью воды в пределах одного образца невозможно. Тем не менее, применение ККТ или МРТ для последовательного наблюдения за деревьями, которые живут в поле является чрезвычайно сложной задачей, поскольку эти инструменты не являются портативными. В отличие от этого, крио-SEM имеет потенциал для использования этой техники на больших деревьях в полевых экспериментах, чтобы четко визуализировать содержание воды не только на клеточном уровне, но и на более тонком уровне структуры, например, вода в межсосудистых ямах15, вода в межклеточные пространства16, или пузырьки в колонке воды17.
Многие исследования наблюдения ксилем воды крио-SEM были зарегистрированы 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi et al. (1996) первоначально установили протокол для наблюдения xylem in situ путем замораживания-фиксации живого ствола через заполнение LN2 в контейнер, установленный на стебель21. Температура образца сохранялась ниже -20 градусов по Цельсию во время сбора образцов и во время подготовки крио-SEM, чтобы избежать таяния льда в ксилемских каналах. Этот метод был использован для наблюдения за водой в ксилеме для уточнения распределения воды при изменении водного режима11,12,24,25,26, 27,28, сезонные колебания распределения воды21,29,30, эффект заморозки оттепели циклов17,31, 32, распределение воды во влажной древесине5, изменения в распределении воды во время перехода от заболоня к heartwood20, сезонный курс времени камбиальной активности и дифференциации сосудов33, и кавитации индуцированных определенных биотических стрессов23,34. Гидравлическая проводимость и уязвимость каналов к кавитации также были проверены с помощью крио-SEM35,36. Cryo-SEM, оснащенный энергетической диспергивной рентгено-рентгенометрической спектрометрией (EDX или EDS), был использован для изучения распределения элементов на поверхности образца, содержащего воду37.
Замораживание-фиксация живого ствола, который содержит каналы под высоким гидравлическим напряжением, иногда вызывает искусственные кавитации, которые наблюдаются крио-SEM как сломанные кристаллы льда в просвете проводников38,39. В частности, широколинейшие виды с более длинными и широкими каналами уязвимы для артефактов, вызванных напряженностью, таких как кавитация, вызванная вырубкой образцов, даже если она проводится под водой3,40. Артефакты кавитации становятся заметными после отбора проб транспирирующегося дерева (т.е. выборки в дневное время) или в условиях сильной засухи, и они могут ввести в заблуждение к завышению кавитации возникновения3,38, 39. Таким образом, напряжение, работая в каналах должен быть освобожден, чтобыизбежать артефактной кавитации 3,12,39.
Техника замораживания-перелома с помощью ножа, установленного в камере образца, часто используется для того, чтобы обнажить поверхность образца для наблюдения крио-SEM. Однако, замерзать-раздробленные плоскости древесных тканей завода, специально поперечные разделы вторичного xylem, слишком грубы для того чтобы ясно наблюдать анатомические характеристики и воду в ткани6. Применение криостата для обрезки образца позволяет быстро и качественно подготовить образец поверхностей20,23. Общая цель этого метода является предоставление доказательств с электронной микроскопии разрешение распределения воды в различных видах клеток ксилем на месте без возникновения выборок артефактов. Мы вводим нашу обновленную процедуру, которая постоянно совершенствуется с тех пор, как мы впервые ее приняли, в отношении отбора проб, обрезки и очистки поверхности образца для получения высококачественных электронных микрографов крио-фиксированных образцов ксилема.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы наблюдения крио-SEM, представленные в настоящем документе, практичны для четкой визуализации распределения воды в клеточном масштабе. С помощью этого метода изучение изменений в распределении воды в ксилеме потенциально может помочь прояснить механизм толерантности видов дере?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана JSPS KAKENHI (Нет. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H0285)
Materials
| coating material | JOEL Ltd., Japan | Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 | |
| cryo scanning electron microscope | JOEL Ltd., Japan | JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS | |
| cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX70 | |
| microtome blade | Thermo Scientific | HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735 | |
| tissue freezing embedding medium | Thermo Scientific | Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006 |
Referencias
- Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. . Xylem structure and the ascent of sap. , (2002).
- Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
- Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al. Xylem embolism refilling and resilience against drought-induced mortality in woody plants: processes and trade-offs. Ecological Research. 33 (5), 839-855 (2018).
- Sano, Y., Okamura, Y., Utsumi, Y. Visualizing water-conduction pathways of living trees: selection of dyes and tissue preparation methods. Tree Physiology. 25 (3), 269-275 (2005).
- Sano, Y., Fujikawa, S., Fukazawa, K. Detection and features of wetwood in Quercusmongolica var. grosseserrata. Trees – Structure and Function. 9 (5), 261-268 (1995).
- Utsumi, Y., Sano, Y. Freeze stabilization and cryopreparation technique for visualizing the water distribution in woody tissues by X-ray imaging and cryo-scanning electron microscopy. Electron Microscopy. (Chapter 30), 677-688 (2014).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high-resolution computed tomography). Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Lee, E. F., Shackel, K. A., Matthews, M. A. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiology. 161 (4), 1820-1829 (2013).
- Choat, B., Badel, E., Burlett, R. E. G., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Noninvasive measurement of vulnerability to drought-induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiology. 170 (1), 273-282 (2016).
- Pratt, R. B., Jacobsen, A. L. Identifying which conduits are moving water in woody plants: a new HRCT-based method. Tree Physiology. 38 (8), 1200-1212 (2018).
- Fukuda, K., Kawaguchi, D., et al. Vulnerability to cavitation differs between current-year and older xylem: nondestructive observation with a compact MRI of two deciduous diffuse-porous species. Plant, Cell and Environment. 38 (12), 2508-2518 (2015).
- Ogasa, M. Y., Utsumi, Y., Miki, N. H., Yazaki, K., Fukuda, K. Cutting stems before relaxing xylem tension induces artefacts in Vitis coignetiae, as evidenced by magnetic resonance imaging. Plant, Cell and Environment. 39 (2), 329-337 (2016).
- Petruzzellis, F., Pagliarani, C., et al. The pitfalls of in vivo imaging techniques: evidence for cellular damage caused by synchrotron X-ray computed micro-tomography. New Phytologist. 220 (1), 104-110 (2018).
- Savi, T., Miotto, A., et al. Drought-induced embolism in stems of sunflower: A comparison of in vivo micro-CT observations and destructive hydraulic measurements. Plant Physiol Biochem. 120, 24-29 (2017).
- Choat, B., Jansen, S., Zwieniecki, M. A., Smets, E., Holbrook, N. M. Changes in pit membrane porosity due to deflection and stretching: the role of vestured pits. Journal of Experimental Botany. 55 (402), 1569-1575 (2004).
- Nakaba, S., Hirai, A., et al. Cavitation of intercellular spaces is critical to establishment of hydraulic properties of compression wood of Chamaecyparis obtusa seedlings. Annals of Botany. 117 (3), 457-463 (2016).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Fujikawa, S., Ohtani, J. The progression of cavitation in earlywood vessels of Fraxinus mandshurica var japonica during freezing and thawing. Plant Physiology. 121 (3), 897-904 (1999).
- McCully, M., Canny, M. J., Huang, C. X. Cryo-scanning electron microscopy (CSEM) in the advancement of functional plant biology. Morphological and anatomical applications. Functional Plant Biology. 36 (2), 97-124 (2009).
- Canny, M. J. Vessel contents of leaves after excision – A test of Scholander’s assumption. American Journal of Botany. 84 (9), 1217-1222 (1997).
- Kuroda, K., Yamashita, K., Fujiwara, T. Cellular level observation of water loss and the refilling of tracheids in the xylem of Cryptomeria japonica during heartwood formation. Trees – Structure and Function. 23 (6), 1163-1172 (2009).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal changes in the distribution of water in the outer growth rings of Fraxinus mandshurica var. Japonica: A study by cryo-scanning electron microscopy. IAWA Journal. 17 (2), 113-124 (1996).
- Ohtani, J., Fujikawa, S. Cryo-SEM observations on vessel lumina of a living tree: Ulmus davidiana var. japonica. IAWA Journal. 11 (2), 183-194 (1990).
- Yazaki, K., Takanashi, T., et al. Pine wilt disease causes cavitation around the resin canals and irrecoverable xylem conduit dysfunction. Journal of Experimental Botany. 69 (3), 589-602 (2018).
- Tyree, M. T., Salleo, S., Nardini, A., Lo Gullo, M. A., Mosca, R. Refilling of embolized vessels in young stems of laurel. Do we need a new paradigm?. Plant Physiology. 120 (1), 11-21 (1999).
- Melcher, P. J., Goldstein, G., et al. Water relations of coastal and estuarine Rhizophora mangle: xylem pressure potential and dynamics of embolism formation. Oecologia. 126 (2), 182-192 (2001).
- Yazaki, K., Sano, Y., Fujikawa, S., Nakano, T., Ishida, A. Response to dehydration and irrigation in invasive and native saplings: osmotic adjustment versus leaf shedding. Tree Physiology. 30 (5), 597-607 (2010).
- Yazaki, K., Kuroda, K., et al. Recovery of physiological traits in saplings of invasive Bischofia tree compared with three species native to the Bonin Islands under successive drought and irrigation cycles. PLoS ONE. 10 (8), e0135117 (2015).
- Umebayashi, T., Morita, T., et al. Spatial distribution of xylem embolisms in the stems of Pinus thunbergii at the threshold of fatal drought stress. Tree Physiology. 36 (10), 1210-1218 (2016).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal and perennial changes in the distribution of water in the sapwood of conifers in a sub-frigid zone. Plant Physiology. 131 (4), 1826-1833 (2003).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Fujikawa, S., Funada, R., Ohtani, J. Visualization of cavitated vessels in winter and refilled vessels in spring in diffuse-porous trees by cryo-scanning electron microscopy. Plant Physiology. 117 (4), 1463-1471 (1998).
- Ball, M. C., Canny, M. J., Huang, C. X., Egerton, J. J. G., Wolfe, J. Freeze/thaw-induced embolism depends on nadir temperature: the heterogeneous hydration hypothesis. Plant, Cell and Environment. 29 (5), 729-745 (2006).
- Mayr, S., Cochard, H., Ameglio, T., Kikuta, S. B. Embolism formation during freezing in the wood of Picea abies. Plant Physiology. 143 (1), 60-67 (2007).
- Kudo, K., Utsumi, Y., et al. Formation of new networks of earlywood vessels in seedlings of the deciduous ring-porous hardwood Quercus serrata in springtime. Trees – Structure and Function. 32 (3), 725-734 (2018).
- Crews, L., McCully, M., Canny, M. J., Huang, C., Ling, L. Xylem feeding by spittlebug nymphs: Some observations by optical and cryo-scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 85 (4), 449-460 (1998).
- Hukin, D., Cochard, H., Dreyer, E., Le Thiec, D., Bogeat-Triboulot, M. B. Cavitation vulnerability in roots and shoots: does Populus euphratica Oliv., a poplar from arid areas of Central Asia, differ from other poplar species?. Journal of Experimental Botany. 56 (418), 2003-2010 (2005).
- Mayr, S., Cochard, H. A new method for vulnerability analysis of small xylem areas reveals that compression wood of Norway spruce has lower hydraulic safety than opposite wood. Plant, Cell and Environment. 26 (8), 1365-1371 (2003).
- Kuroda, K., Yamane, K., Itoh, Y. Cellular level in planta analysis of radial movement of artificially injected caesium in Cryptomeria japonica xylem. Trees – Structure and Function. 100 (8), 1-13 (2018).
- Cochard, H., Bodet, C., Ameglio, T., Cruiziat, P. Cryo-scanning electron microscopy observations of vessel content during transpiration in walnut petioles. Facts or artifacts?. Plant Physiology. 124 (3), 1191-1202 (2000).
- Umebayashi, T., Ogasa, M. Y., Miki, N. H., Utsumi, Y., Haishi, T., Fukuda, K. Freezing xylem conduits with liquid nitrogen creates artifactual embolisms in water-stressed broadleaf trees. Trees – Structure and Function. 30 (1), 305-316 (2016).
- Wheeler, J. K., Huggett, B., Tofte, A. N., Rockwell, F. E., Holbrook, N. M. Cutting xylem under tension or supersaturated with gas can generate PLC and the appearance of rapid recovery from embolism. Plant, Cell and Environment. 36 (11), 1938-1949 (2013).
- Canny, M. J., Huang, C. X. The cohesion theory debate continues. Trends In Plant Science. 6 (10), 454-456 (2001).
- Suuronen, J. -. P., Peura, M., Fagerstedt, K., Serimaa, R. Visualizing water-filled versus embolized status of xylem conduits by desktop x-ray microtomography. Plant Methods. 9 (1), 11 (2013).
