Distribución de agua de Xylem en plantas leñosas visualizada con un microscopio electrónico de barrido crio-
Summary
Observar la distribución del agua dentro del xilema proporciona información significativa sobre la dinámica del flujo de agua en las plantas leñosas. En este estudio, demostramos el enfoque práctico para observar la distribución de agua de xilema in situ mediante el uso de un criostato y crio-SEM, que elimina los cambios más recientes en el estado del agua durante la preparación de la muestra.
Abstract
Una criounidad de microscopio electrónico de barrido instalada (crio-SEM) permite la observación de muestras a temperaturas bajo cero y se ha utilizado para explorar la distribución de agua en tejidos vegetales en combinación con técnicas de fijación de congelación utilizando nitrógeno líquido (LN 2). Sin embargo, para las especies leñosas, los preparados para observar la superficie de corte transversal de xilema implican algunas dificultades debido a la orientación de las fibras de madera. Además, una mayor tensión en la columna de agua en los conductos de xilema puede ocasionalmente causar cambios artígrados en la distribución del agua, especialmente durante la fijación y recolección de la muestra. En este estudio, demostramos un procedimiento eficiente para observar la distribución de agua dentro del xilema de plantas leñosas in situ mediante el uso de un criostato y crio-SEM. Al principio, durante la recolección de muestras, la medición del potencial de agua de xilema debe determinar si hay alta tensión en los conductos de xilema. Cuando el potencial de agua de xilema es bajo (< aprox. 0,5 MPa), se necesita un procedimiento de relajación de tensión para facilitar una mejor preservación del estado del agua en conductos de xilema durante la fijación por congelación de la muestra. A continuación, se une un collar estanco alrededor del tallo del árbol y se llena con LN2 para la fijación de congelación del estado del agua de xylem. Después de la cosecha, se debe tener cuidado de asegurar que la muestra se conserve congelada mientras se completan los procedimientos de preparación de la muestra para la observación. Se emplea un criostato para exponer claramente la superficie transversal de xilema. En las observaciones crio-SEM, se requiere un ajuste de tiempo para el grabado en congelación para eliminar el polvo de escarcha y acentuar el borde de las paredes celulares en la superficie de visualización. Nuestros resultados demuestran la aplicabilidad de las técnicas crio-SEM para la observación de la distribución de agua dentro de xilemas a nivel celular y subcelular. La combinación de crio-SEM con técnicas de observación in situ no destructivas mejorará profundamente la exploración de la dinámica de flujo de agua de las plantas leñosas.
Introduction
La disponibilidad de recursos hídricos (es decir, precipitación, contenido de agua del suelo) determina estrictamente la mortalidad y la distribución geográfica de las especies vegetales, ya que necesitan absorber el agua del suelo y transportarla a las hojas para la producción fotosintética. Las plantas deben mantener su sistema de transporte de agua bajo suministros de agua fluctuantes. En particular, las plantas leñosas generan altas tensiones en sus conductos a lo largo de los arroyos de transpiración, ya que, en algunos casos, necesitan sostener su corona más de 100 m sobre el suelo. Para mantener las columnas de agua bajo tan alta presión negativa, los conductos de xilema consisten en un continuo de células tubulares con paredes celulares rígidas e hidrofóbicas-lignificadas1. La vulnerabilidad a la disfunción xilema de los conductos de xilema en cada especie es un buen determinante de la supervivencia de la especie bajo el suministro de agua fluctuante2. Además, el estudio del estado del agua de los conductos de xilema es importante para la evaluación de la condición de salud de los árboles individuales sometidos a tensiones abióticas o bióticas. La medición del flujo de savia o del potencial hídrico puede proporcionar estimaciones del estado del agua de una planta leñosa debido a la función hidráulica integrada de los conductos de xilema. Además, la visualización de la distribución de agua en células xilem puede aclarar el estado de los componentes individuales del sistema hidráulico xilema.
Existen varias técnicas para visualizar el estado del agua de los conductos de xilema3. Los métodos clásicos y útiles para observar las vías del agua en el tejido leñoso implican la tinción de la columna de agua sumergiendo los extremos de las ramas cortadas en un tinte o inyectando un tinte en los tallos de los árboles de pie4. La fotografía de rayos X suave también permite la visualización de la distribución de agua de discosde madera en rodajas debido a la intensidad diferencial de absorción de rayos X de la humedad en xylem 5,6. Estos métodos, sin embargo, sólo proporcionan pistas de movimiento del agua o demuestran distribuciones macroscópicas de agua. Recientemente, técnicas de observación no destructivas, tales como la tomografía computarizada por rayos X de microfoco (CT)7,8,9,10y la resonancia magnética (RM)11, 12, se han mejorado significativamente para permitir la observación del agua en conductos de xilema dentro de los árboles intactos. Estos métodos no destructivos tienen grandes ventajas en el que podemos observar el estado del agua del xilema sin efectos de corte artificiales, y podemos rastrear la dinámica del flujo de agua mediante imágenes secuenciales o introduciendo un agente de contraste10. Sin embargo, necesitamos utilizar una resonancia magnética personalizada para la toma de imágenes de plantas o una instalación especializada para la ctuta ción basada en sincrotrón con el fin de obtener las imágenes que pueden identificar el contenido de agua a nivel celular. Además, aunque el sistema de caños basado en sincrotrón permite obtener imágenes finas con alta resolución espacial, que es comparable a la microscopía de luz7,8,9, las células vivas pueden ser lesionadas por el radiación de rayos X de alta energía13,14. El uso de un microscopio electrónico de barrido en el que se instalan criounidades (crio-SEM) es un método muy útil para localizar con precisión el agua en xilema a nivel celular, aunque esto requiere la recolección destructiva de la muestra para la observación. Para fijar el agua en conductos de xilema, una parte de los tallos (es decir, ramas, ramas o tallos) se congelan in situ por nitrógeno líquido (LN2). Las observaciones de la superficie de los especímenes recortados y congelados por crio-SEM proporcionan imágenes altamente magnificadas de la estructura xilema a partir de las cuales podemos identificar el agua en conductos de xilema como hielo. Una limitación significativa de este método es que la observación secuencial de la movilidad del agua dentro de la misma muestra es imposible. Sin embargo, la aplicación de la “CT” o de la RMN para la observación secuencial de los árboles que viven en un campo es extremadamente difícil porque estos instrumentos no son portátiles. Por el contrario, crio-SEM tiene un potencial para utilizar esta técnica en árboles grandes en experimentos de campo para visualizar claramente el contenido de agua no sólo a nivel celular, sino también a un nivel de estructura más fino, por ejemplo, agua en pozos intervasculares15, agua en espacios intercelulares16,o burbujas en la columna de agua17.
Muchos estudios observando el agua xilema por crio-SEM se han reportado 5,12,18,19,20,21,23. (1996) establecieron inicialmente el protocolo de observación del xilema in situ mediante la liofilización de un tronco vivo mediante el llenado de LN2 en un recipiente situado en el tallo21. La temperatura de la muestra se mantuvo por debajo de -20 oC durante la recolección de la muestra y durante la preparación crio-SEM con el fin de evitar el derretimiento del hielo dentro de los conductos de xilema. Este método se ha utilizado para observar el agua en xilema con el fin de aclarar la distribución del agua bajo el régimen cambiante de agua11,12,24,25,26, 27,28, la variación estacional de la distribución de agua21,29,30, el efecto de los ciclos de congelación-descongelación17,31, 32, la distribución de agua en madera húmeda5, cambios en la distribución del agua durante la transición de la madera de savia a la madera de samanjística20, curso de tiempo estacional de la actividad cambiaria y diferenciación de los vasos33, y la cavitación inducida por ciertas tensiones bióticas23,34. También se ha verificado la conductividad hidráulica y la vulnerabilidad de los conductos a la cavitación utilizando crio-SEM35,36. Cryo-SEM equipado con espectrometría de rayos X de dispersión de energía (EDX o EDS) se ha utilizado para estudiar la distribución de elementos sobre la superficie de un espécimen que contiene agua37.
La congelación de un tronco vivo que contiene conductos bajo alta tensión hidráulica a veces provoca cavitaciones artificiales que son observadas por crio-SEM como cristales de hielo fracturados en el lumen de los conductos38,39. En particular, las especies de hojas anchas con conductos más largos y anchos son vulnerables a artefactos inducidos por la tensión, como la cavitación causada por el corte de muestras, incluso si se llevan a cabo bajo el agua3,40. Los artefactos de cavitación se vuelven visibles después del muestreo de un árbol transpirante (es decir, muestreo durante el día) o en condiciones severas de sequía y pueden inducir a error a una sobreestimación de la ocurrencia de cavitación3,38, 39. Por lo tanto, la tensión que funciona en los conductos tiene que ser liberada con el fin de evitar la cavitación artifreal3,12,39.
La técnica de fractura por congelación utilizando un cuchillo instalado en una cámara de muestras se emplea a menudo para exponer la superficie de la muestra para la observación crio-SEM. Sin embargo, los planos fracturados por congelación de los tejidos vegetales leñosos, especialmente las seccionestransversales del xilema secundario, son demasiado ásperos para observar claramente las características anatómicas y el agua en el tejido 6. La aplicación de un criostato para recortar una muestra permite una preparación rápida y de alta calidad de las superficies de la muestra20,23. El objetivo general de este método es proporcionar evidencia con resolución de microscopía electrónica de la distribución de agua en varios tipos de células xilem in situ sin la ocurrencia de artefactos de muestreo. Presentamos nuestro procedimiento actualizado, que se ha mejorado constantemente desde que lo adoptamos por primera vez, en relación con el muestreo, recorte y limpieza de la superficie de la muestra para obtener micrografías electrónicas de alta calidad de muestras criofijas de xilema.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos de observación crio-SEM introducidos en este artículo son prácticos para visualizar claramente la distribución del agua a escala celular. A través de este método, explorar los cambios en la distribución del agua dentro de xylem puede ayudar potencialmente a aclarar el mecanismo de tolerancia de las especies arbóreas al estrés abiótico (escasez o congelación de agua) o estrés biótico (enfermedad del árbol).
El paso más crucial en este método es preservar la distribu…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI (No. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)
Materials
| coating material | JOEL Ltd., Japan | Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 | |
| cryo scanning electron microscope | JOEL Ltd., Japan | JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS | |
| cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX70 | |
| microtome blade | Thermo Scientific | HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735 | |
| tissue freezing embedding medium | Thermo Scientific | Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006 |
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