JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Investigación sobre el cáncer

Üç boyutlu kemik hücre dışı matriks modeli osteosarkom için

Published: April 12, 2019
doi:
10.3791/59271
, ,
1MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation, School of Life Sciences,Sun Yat-sen University

Summary

Kemik hücre dışı Matriks (BEM) modeli osteosarkom (OS) için de kurulan ve gösterilen işte. Bu uygun bir iskele birincil tümör büyüme vitro taklit ve OS histolojik ve cytogenic heterojenlik eğitim için ideal bir model sağlamak için kullanılabilir.

Abstract

Osteosarkom (OS) en yaygın ve çok agresif birincil kemik tümörü var. Bu tanılama ya da prognostik zorluklar ile birlikte histolojik ve anatomik varyasyonlar ile karakterizedir. İşletim sistemi genotypically ve phenotypically türdeş olmayan kanser hücreleri oluşur. Kemik microenvironment öğeleri hesabına tümör heterojenite ve hastalık ilerleme için kanıtlanmıştır. Kemik hücre dışı Matriks (BEM) microstructural Matrisler ve biyokimyasal yerel hücre dışı matriks bileşenlerinin korur. Bu doku özel niş bir olumlu ve uzun vadeli iskele OS hücre tohum ve yayılması için sağlar. Bu makalede, BEM modeli ve daha fazla deneysel uygulama hazırlanması için bir iletişim kuralı sağlar. İşletim sistemi hücreleri büyümek ve birden çok fenotipleri OS klinik örneklerin histopatolojik karmaşıklığı ile tutarlı içine ayırt etmek. Model aynı zamanda çeşitli türleri morfoloji ve onların dernek genetik değişiklikler ve temel düzenleyici mekanizmaları ile görselleştirme sağlar. İnsan OS için homolog olarak bu BEM-OS model olabilir geliştirilen ve patoloji ve klinik araştırma OS için uygulanır.

Introduction

Osteosarkom (OS) genellikle alanları, uzun kemikler, metaphysis ergenlik döneminde aktif büyüyen oluşur. OS etkilenen sitelerin % 80’den fazla proksimal tibia ve proksimal humerus hem de büyüme plaka1konumuna karşılık gelen distal ve proksimal femur metaphysis için tercih var. OS Mezenkimal özellikleri ve histolojik özellikleri ve sınıf içinde önemli çeşitlilik ile birden çok hücre alt türlerinden oluşur. Delillerin Mezenkimal Kök hücre (MSCs), dokusunu taahhüt öncüleri ve perisitlerden kökenli2,3,4,5hücreler olarak destekler. Bu hücreler genetik veya epigenetik değişiklikler birikir ve çıkmasına OS için bazı kemik microenvironmental sinyalleri etkisi altında. İçsel ve dışsal mekanizmaları genomik istikrarsızlık ve OS, heterojen birden çok morfolojik ve klinik fenotipleri6,7ile sonuçlanır. Bireyselleştirilmiş tedavi veya yeni uyuşturucu testi ile taranması için roman modelleri heterojenite veya diğer klinik bozukluklar karşı oluşturulması gerekiyor.

İşletim sistemi bir intra kemik Malign solid tümör var. Karmaşıklığı ve microenvironment öğeleri çevresindeki etkinlik fenotipik ve işlevsel farklılıklar üzerine farklı yerlerde tümör hücrelerinde OS görüşmek. Kemik hücre dışı Matriks (BEM) bir yapısal ve biyokimyasal iskele mineral ifade ve kemik remodeling için sağlar. Hücre dışı Matriks (ECM) organik bölümünü esas oluşur türü ben iken, mineralized kısmı Kalsiyum fosfat hidroksiapatit8şeklinde oluşan osteoblastik lineage hücreleri tarafından salgılanan kollajen. ECM ağlar dinamik rolü hücre adezyon düzenlemektir, farklılaşma, çapraz-hadis ve doku bakım9fonksiyonu.

Demineralize BEM ve ECM hydrogels başarılı bir şekilde hücre kültüründe kullanılmıştır ve Hücre proliferasyonu10,11geliştirebilirsiniz. Yapay kemik gibi ECM havuz boyutu, kader karar ve soy ilerleme MSCs12,13,14düzenleyen. Ayrıca, sonuçları Osteojenik etkinlik kemik oluşumu ve rejenerasyon15,16,17sırasında uyarıcı hücresel süreçler tarafından sağlamak için klinik önemini kanıtlar.

Bu makalede, bizim grup değiştirilmiş modeli ve üç boyutlu uzun vadeli kültür için uygun bir alternatif oluşturur. İşletim sistemi hücreleri doku kaynaklı BEM enjekte heterogeneously Mezenkimal fenotip kolayca plastik iki boyutlu kültürleri ile karşılaştırıldığında sunuyoruz. İşletim sistemi yerel bir niş olmak vitro hücreleri ve OS teorik ve klinik araştırmalarda büyük bir potansiyele sahip BEM siteye özgü homolog doku gösterisinden dramatik avantajı elde. Bu karakterize BEM platform basit ama verimli vitro araştırma ve birden fazla kanser modelleme uzatılabilir.

Protocol

Hayvan bakım ve kullanım Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri göre bakım ve kullanmak, laboratuvar hayvanları (NIH yayın NO.80-23, 1996 yılında revize) hayvan Etik Komitesi, Sun Yat-Sen’in Üniversitesi onayını sonra yapılmaktadır. 1. kemik hazırlık 4’e 6-hafta-yaşlı BALB/c fare (olmadan seks özel gereksinim) edinin. Bir fare aseptik tarafından servikal çıkığı ötenazi ve taze fibula, tibia ve uyluk bir hindlimb üzerinden steril cerrahi makasla kesti. Epitel d…

Representative Results

Demineralizasyon ve decellularization sonra BEM daha güçlü esneklik ve yerel fare kemiğe göre azim ile yarı saydam olarak düşünülür. Küçük kas kalıntı ve medüller kavite boşluk (şekil 1A, B) açıkça görülebilmektedir. BEM etkili decellularization belirlemek için BEM fiksasyon sonra parafin içinde gömülü olup Hematoksilen-Eozin (H & E) boyama için 3-5 mikron bölümlere dilimlenmiş. Hücre çekirdeği ayrıntılı kaldırılması parlak alan gör…

Discussion

Genel olarak, işletim sistemi olarak osteoblastik sınıflandırılabilir, chondroblastic ve fibroblastic alt türlerinden bağlı olarak kendi baskın histolojik bileşeni. Onun prognoz sadece ama aynı zamanda anatomik kendi sitesindeki histolojik parametreleri bağlıdır. Kemik ve extraosseous siteleri19yüzeylerde (intramedüller veya intracortical bölme), kemikleri içinde ortaya çıkabilir. Ortaya çıkması ve OS heterojen bir fiil oncogenic olaylar ve uzak organlara2…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar destek Liuying Chen için onun yönetim yardım ve uzun Zhao kemik hücre dışı matriks iskele inşaatı sırasında onun mükemmel teknik destek için değer. Bu çalışmada hibe Ulusal doğal Bilim Vakfı, Çin’den (31871413) tarafından desteklenmektedir.

Materials

15 mL centrifuge tube Greiner 188271
50 mL centrifuge tube Greiner 227270
6 cm cell culture dish Greiner 628160
6-well plate Greiner 657160
Ampicillin Sigma-Aldrich A9393
C57-BL/6J mouse Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center
CO2 incubator SHEL LAB SCO5A
Dibasic sodium phosphate Guangzhou Chemical Reagent Factory BE14-GR-500G
DMEM/F12 Sigma-Aldrich D0547
Fetal bovine serum Hyclone SH30084.03
Hemocytometer BLAU 717805
Kanamycin Sigma-Aldrich PHR1487
MG-63 Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank Human osteosarcoma cell line
MNNG/HOS Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank Human osteosarcoma cell line
Phenol red Sigma-Aldrich P4633 A solution of phenol red is used as a pH indicator: its color exhibits a gradual transition from yellow to red over the pH range 6.6 to 8.0.
Potassium chloride Sangon Biotech A100395
Potassium Phosphate Monobasic Sangon Biotech A501211
Sodium chloride Sangon Biotech A501218
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: State of the art. Cancer Treatment Reviews. 32, 423-436 (2006).
  2. Mohseny, A. B., et al. Osteosarcoma originates from mesenchymal stem cells in consequence of aneuploidization and genomic loss of Cdkn2. Journal of Pathology. 219, 294-305 (2009).
  3. Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Cells of origin in osteosarcoma: mesenchymal stem cells or osteoblast committed cells. Bone. 62, 56-63 (2014).
  4. Sato, S., et al. Mesenchymal tumors can derive from Ng2/Cspg4-Expressing pericytes with β-Catenin modulating the neoplastic phenotype. Cell Reports. 16, 917-927 (2016).
  5. Patane, S., et al. MET overexpression turns human primary osteoblasts into osteosarcomas. Investigación sobre el cáncer. 66, 4750-4757 (2006).
  6. Poos, K., et al. Genomic heterogeneity of osteosarcoma – shift from single candidates to functional modules. PLoS One. 10, 123082 (2015).
  7. Martin, J. W., Squire, J. A., Zielenska, M. The genetics of osteosarcoma. Sarcoma. 2012, 1-11 (2012).
  8. Alfranca, A., et al. Bone microenvironment signals in osteosarcoma development. Cellular and Molecular Life Sciences. 72, 3097-3113 (2015).
  9. Alford, A. I., Kozloff, K. M., Hankenson, K. D. Extracellular matrix networks in bone remodeling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 20-31 (2015).
  10. Sawkins, M. J., et al. Hydrogels derived from demineralized and decellularized bone extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 9, 7865-7873 (2013).
  11. Alom, N., Peto, H., Kirkham, G. R., Shakesheff, K. M., Bone White, L. J. Bone extracellular matrix hydrogel enhances osteogenic differentiation of C2C12 myoblasts and mouse primary calvarial cells. Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials. 106, 900-908 (2018).
  12. Datta, N., Holtorf, H. L., Sikavitsas, V. I., Jansen, J. A., Mikos, A. G. Effect of bone extracellular matrix synthesized in vitro on the osteoblastic differentiation of marrow stromal cells. Biomaterials. 26, 971-977 (2005).
  13. Rubio, R., et al. Bone environment is essential for osteosarcoma development from transformed mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1136-1148 (2014).
  14. Sadr, N., et al. Enhancing the biological performance of synthetic polymeric materials by decoration with engineered, decellularized extracellular matrix. Biomaterials. 33, 5085-5093 (2012).
  15. Gautschi, O. P., Frey, S. P., Zellweger, R. Bone morphogenetic proteins in clinical applications. Anz Journal of Surgery. 77, 626-631 (2007).
  16. Rochet, N., et al. Modification of gene expression induced in human osteogenic and osteosarcoma cells by culture on a biphasic calcium phosphate bone substitute. Bone. 32, 602-610 (2003).
  17. Spang, M. T., Christman, K. L. Extracellular matrix hydrogel therapies: in vivo applications and development. Acta Biomaterialia. 68, 1-14 (2018).
  18. Schenke-Layland, K., et al. Impact of decellularization of xenogeneic tissue on extracellular matrix integrity for tissue engineering of heart valves. Journal of Structural Biology. 143, 201-208 (2003).
  19. Klein, M. J., Siegal, G. P. Osteosarcoma: anatomic and histologic variants. American Journal of Clinical Pathology. 125, 555-581 (2006).
  20. Lipinski, K. A., et al. Cancer evolution and the limits of predictability in precision cancer medicine. Trends in Cancer. 2, 49-63 (2016).
  21. McGranahan, N., Swanton, C. Clonal heterogeneity and tumor evolution: past, present, and the future. Cell. 168, 613-628 (2017).
  22. Brown, H. K., Schiavone, K., Gouin, F., Heymann, M., Heymann, D. Biology of bone sarcomas and new therapeutic developments. Calcified Tissue International. 102, 174-195 (2018).
  23. Abarrategi, A., et al. Osteosarcoma: cells-of-origin, cancer stem cells, and targeted therapies. Stem Cells International. 2016, 1-13 (2016).
  24. Tsukamoto, S., et al. Mesenchymal stem cells promote tumor engraftment and metastatic colonization in rat osteosarcoma model. International Journal of Oncology. 40, 163-169 (2012).
  25. Rodriguez, C. J., et al. Aerosol gemcitabine: preclinical safety and in vivo antitumor activity in osteosarcoma-bearing dogs. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 197-206 (2010).
  26. Rodriguez, C. J. Using canine osteosarcoma as a model to assess efficacy of novel therapies: Can old dogs teach us new tricks. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 237-256 (2014).
  27. Mohseny, A. B., et al. An osteosarcoma zebrafish model implicates Mmp-19 and Ets-1 as well as reduced host immune response in angiogenesis and migration. Journal of Pathology. 227, 245-253 (2012).
  28. Saalfrank, A., et al. A porcine model of osteosarcoma. Oncogenesis. 5, 210 (2016).
  29. Zhang, Y., Pan, Y., Xie, C., Zhang, Y. MiR-34a exerts as a key regulator in the dedifferentiation of osteosarcoma via PAI-1–Sox2 axis. Cell Death & Disease. 9, (2018).
  30. Hashimoto, Y., et al. The effect of decellularized bone/bone marrow produced by high-hydrostatic pressurization on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Biomaterials. 32, 7060-7067 (2011).
  31. Benders, K. E. M., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31, 169-176 (2013).
  32. Grayson, W. L., et al. Effects of initial seeding density and fluid perfusion rate on formation of tissue-engineered bone. Tissue Engineering Part A. 14, 1809-1820 (2008).
  33. Mikulic, D., et al. Tumor angiogenesis and outcome in osteosarcoma. Pediatric Hematology and Oncology. 21, 611-619 (2004).
  34. Ren, K., et al. Vasculogenic mimicry: a new prognostic sign of human osteosarcoma. Human Pathology. 45, 2120-2129 (2014).
  35. Bonuccelli, G., et al. Role of mesenchymal stem cells in osteosarcoma and metabolic reprogramming of tumor cells. Oncotarget. 5, 7575-7588 (2014).

Tags

3D Bone Extracellular MatrixOsteosarcomaDecellularizationBone-derived MatrixBone Tumor ResearchHeterogenous MorphologyDrug SensitivityEwing SarcomaMetastatic Bone TumorsBALB/c MiceBone DecalcificationLipid Extraction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Zhang, Y., Yao, Y., Zhang, Y. Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma. J. Vis. Exp. (146), e59271, doi:10.3791/59271 (2019).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image