다른 식물 종에서 촬영 정점 Meristems의 confocal 라이브 영상
Summary
이 프로토콜 라이브 이미지 촬영 정점 meristems 레이저 스캐닝 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다른 식물 종에서 분석 하는 방법을 제공 합니다.
Abstract
줄기 세포 보존된 저수지와 그것으로 촬영 정점 분열 조직 (SAM) 함수 postembryonic 개발 하는 동안 거의 모든 지상 직물을 생성 합니다. 활동 및 SAMs의 형태학 생식 기관, 그리고 가장 중요 한 것은, 곡물 수확량의 촬영 아키텍처, 크기와 같은 중요 한 농경 특성을 결정합니다. 여기, 우리는 레이저 confocal 현미경 검사를 통해 표면 형태와 다른 종에서 살아있는 SAMs의 내부 세포의 구조를 분석 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 내에서 높은 해상도의 3 차원 (3D) 이미지 수집 샘플 준비에서 모든 절차를 수행할 수 있습니다 짧은 20 분. 이 프로토콜은 고효율 화 서 조직과의 개발을 공부 하는 간단 하지만 강력한 도구를 제공 하는 모델 종 뿐만 아니라 다른 작물에서 식물 meristems의 SAMs 뿐만 아니라 공부에 대 한 설명 다른 식물 종에 걸쳐 meristems입니다.
Introduction
식물 분열 조직 미 분화 줄기 세포의 수영장을 포함 하 고 지속적으로 격려 하 고 식물의 기관 성장과 개발1. Postembryonic 개발 하는 동안 식물의 거의 모든 지상 직물은 싹 정점 분열 조직 (SAM)에서 파생 됩니다. 작물, 활동 및 SAM과 그 파생된 꽃 meristems의 크기는 촬영 아키텍처, 과일 생산, 씨 수확량 등 많은 농경 특성 밀접 하 게 연관 된다. 예를 들어 토마토, 확대 샘 하면 촬영 및 꽃이 핌 분기, 증가 하 고 따라서 여분의 꽃 및 과일 장기2생성 결과. 옥수수에서 SAM 크기 증가 더 높은 씨 수 및 총 수익률3,4이끌어 낸다. 콩, 분열 조직 불확정성 촬영 아키텍처에 밀접 하 게 연관 이며 또한5항복.
형태학 및 SAMs의 여러 가지 방법으로, 조직학 단면/얼룩 및 스캐닝 전자 현미경 (SEM)6를 포함 하 여 둘 다 크게 제공을 통해 분열 조직 연구 고급 나타낼 수 있다 중 단면 보기 또는 SAMs의 3 차원 (3D) 표면 보기. 그러나, 두 방법 모두 시간이 걸리고, 데이터 수집, 샘플 준비에서 몇 가지 실험 단계를 포함 되며 이러한 메서드는 주로 고정된 샘플에 따라 달라 집니다. 레이저 스캐닝 confocal 현미경 검사 법 기술에서에서의 최근 발전 이러한 한계를 극복 하 고 세포의 구조 및 식물 조직 및 장기7,8의 발달 과정을 조사 하는 강력한 도구를 제공. 통해 물리적 조직 보다 광 단면, confocal 현미경 검사 법 수 수 일련의 z-스택 이미지 및 이미지 분석 소프트웨어를 통해 샘플의 후속 3D 재구성의 컬렉션.
여기, 우리 둘 다 내부 조사에 대 한 효율적인 절차에 설명 하 고 다른 생활 SAMs의 표면 구조 식물 종 레이저 confocal 현미경 검사 법, 잠재적으로 모든 실험을 수행 하는 연구를 수 있는 스캔을 사용 하 여 프로세스 내에서 20 분으로 짧은. 애기 꽃이 핌 SAMs9,10,11,12,,1314의 라이브 confocal 영상에 대 한 다른 게시 된 방법에서 다른 15 와 애기 꽃12,13, 여기이 프로토콜은 매우 효율적인 모델 종 뿐만 아니라 식물 촬영의 꽃이 핌 meristems 뿐만 아니라 공부에 대 한 설명 토마토, 콩 등 다른 작물에서 정점 meristems. 이 방법은 유전자 변형 형광 표식에 의존 하지 않는 하 고 잠재적으로 많은 다른 종 및 재배 품 정에서 촬영 meristems 연구에 적용할 수 있습니다. 또한, 우리는 또한 간단한 이미지 보기 및 3D 뷰에서 다른 SAMs를 분석 하기 위한 단계를 처리 소개 합니다. 함께 찍은,이 간단한 방법을 더 나은 구조와 모형 유기 체 및 작물에서 meristems의 발달 과정을 이해 하는 연구를 촉진 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리가 설명 사소한 수정, 다른 식물에서 촬영 정점 meristems의 연구에 적용할 수 있는 간단한 이미징 방법 모델 식물에서 식물 및 생식 단계에서 분열 조직 규칙을 공부 하는 새로운 길을 열기와 작물입니다. 현미경 및 조직학 얼룩 방법을 달리이 프로토콜 표면 보기와 노동 집약적인 샘플 고정 및/또는 단계를 구분 하는 조직에 대 한 필요 없이 SAMs의 내부 세포 구조를 공개 도울 수 있다. 이 ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
레이저 confocal 현미경 검사에 액세스 하기 위한 그리고 기술 지원에 대 한 저자 퍼듀 Bindley 생명과학 센터 이미징 시설을 인정 하 고 저자 앤디 Schaber 퍼듀 Bindley 이미징 시설에서에서 도움을 주셔서 감사 합니다. 이 활동은 Purdue 대학 인디애나의 농업 및 농촌 개발을 지원 하기 위해 자금 AgSEED 교차로의 한 부분으로에 의해 투자 되었다.
Materials
| Agar Phyto | Dot Scientific Inc. | DSA20300-1000 | |
| Agarose | Dot Scientific Inc. | AGLE-500 | |
| Forceps | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices. |
| LSM 880 Upright Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog MS medium | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 water dipping lens | Zeiss | ||
| Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm | CELLTREAT Scientific Products | 229694 | Use as making MS plates |
| Plastic petri dishes60 mm X 15 | CELLTREAT Scientific Products | 229665 | Use as imaging dishes |
| Propagation Mix | Sungro Horticulture | ||
| Propidium iodide | Acros Organics | 440300250 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| Razor blade | PERSONNA | 62-0179 | For cutting shoot apex from plants |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Tissue | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | Image acquisition software |
Referencias
- Meyerowitz, E. M. Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell. 88 (3), 299-308 (1997).
- Xu, C., et al. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato. Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).
- Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus. Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).
- Je, B. I., et al. Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits. Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).
- Ping, J., et al. Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean. Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).
- Vaughan, J. G., Jones, F. R. Structure of the angiosperm inflorescence apex. Nature. 171, 751 (1953).
- Sijacic, P., Liu, Z. Novel insights from live-imaging in shoot meristem development. Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).
- Tax, F. E., Durbak, A. Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems. Plant Cell. 18 (6), 1331 (2006).
- Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem. Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).
- Prunet, N. Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers. Journal of Visualized Experiments. (122), e55156 (2017).
- Prunet, N., et al. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Biología del desarrollo. 419, 114-120 (2016).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131, 4225-4237 (2004).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 773 (2017).
- Zhou, Y., et al. HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers. Science. 361 (6401), 502-506 (2018).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases. Development. 142 (6), 1043 (2015).
- Li, W., et al. LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation. Science Signaling. 6 (270), ra23 (2013).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
