Proyección de imagen confocal vivo de meristemos apicales de brotes de diferentes especies de plantas
Summary
Este protocolo presenta cómo viven la imagen y analizar los meristemos apicales de brotes de diferentes especies de plantas mediante microscopía confocal de barrido láser.
Abstract
Las funciones de meristemo apical (SAM) de disparar como un reservorio de células madre conservadas y genera casi todos los tejidos sobre el suelo durante el Desarrollo postembrionario. La actividad y la morfología de SAMs determinan características agronómicas importantes, tales como arquitectura de disparar, el tamaño y número de órganos reproductivos y lo más importante, rendimiento de grano. Presentamos un protocolo detallado para el análisis de la morfología superficial y la estructura celular interna de la vida del SAMs de diferentes especies a través del microscopio confocal de barrido láser. Todo el procedimiento de la preparación de la muestra a la adquisición de imágenes (3D) tridimensionales de alta resolución puede lograrse dentro de tan corto como 20 minutos. Demostramos que este protocolo es muy eficiente para estudiar no sólo la inflorescencia SAMs de la especie modelo, sino los meristemos vegetativos de diferentes cultivos, proporcionando una herramienta simple pero poderosa para estudiar la organización y desarrollo de meristemos en diferentes especies de plantas.
Introduction
El meristemo de la planta contiene una reserva de células madre no diferenciadas y sostiene continuamente la planta órgano crecimiento y desarrollo1. Durante el Desarrollo postembrionario, casi todos los tejidos sobre el suelo de una planta se derivan desde el meristemo apical de brote (SAM). En los cultivos, la actividad y el tamaño del SAM y sus derivados meristemos florales están estrechamente asociadas con muchas características agronómicas tales como disparar arquitectura, producción de frutos y rendimiento de semilla. Por ejemplo, en tomate, un SAM ampliado causa un aumento en el brote y la ramificación de la inflorescencia y así resultados en la generación extra flor y fruta órganos2. En maíz, un aumento de tamaño de SAM lleva a un mayor número de semillas y rendimiento total3,4. En soja, la indeterminación del meristemo también está estrechamente relacionada con la arquitectura de disparar y rendimiento5.
La morfología y anatomía de Sam se caracteriza por varios métodos, incluyendo el seccionamiento, tinción histológica y exploración de la microscopia electrónica (SEM)6, los cuales han avanzado grandemente la investigación meristemo proporcionando la seccional vista o una tridimensional (3D) superficie de Sam. Sin embargo, ambos métodos son lentos, que implica varias medidas experimentales de la preparación de la muestra para la adquisición de datos, y estos métodos dependen principalmente de muestras fijadas. Avances recientes en la técnica de microscopía confocal de escaneo láser han superado estas limitaciones y nos proporcionan una herramienta poderosa para investigar la estructura celular y el proceso de desarrollo de la planta tejidos y órganos7,8. A través de óptica en lugar de tejido físico microscopia confocal, seccionamiento permite la colección de una serie de imágenes z-stack y la posterior reconstrucción 3D de la muestra a través de software de análisis de imagen.
Aquí, describimos un procedimiento eficiente para investigar tanto dentro de estructuras superficiales de la vida del SAMs de diferentes especies y vegetales mediante láser, microscopía confocal, que potencialmente permite a los investigadores para llevar a cabo la experimental proceso dentro de tan corto como 20 minutos. Diferente de otros métodos publicados para la proyección de imagen confocal vivo de Arabidopsis inflorescencia SAMs9,10,11,12,13,14, 15 y Arabidopsis flores12,13, aquí demostramos que este protocolo es muy eficiente para estudiar no sólo los meristemas de inflorescencia de la especie modelo, sino el brote vegetativo meristemos apicales de diferentes cultivos, como tomate y soja. Este método no se basa en marcadores fluorescentes transgénicos y potencialmente se puede aplicar para estudiar los meristems del lanzamiento de muchas especies y cultivares. Además, presentamos los pasos para ver y analizar las diferentes SAMs en una vista 3D de procesamiento de imágenes simple. Tomados en conjunto, este sencillo método facilitará a los investigadores comprender mejor la estructura y el proceso de desarrollo de los meristemos de organismos modelo y cultivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos un método simple de imágenes que se puede aplicar al estudio de los meristemos apicales de brotes de diversas plantas con modificaciones menores, abriendo una nueva vía para estudiar la regulación del meristemo en etapas vegetativas y reproductivas en plantas modelo y de los cultivos. En contraste con el SEM y los métodos de tinción histológicos, este protocolo puede ayudar a revelar más superficie y estructuras celulares internas de SAMs, sin necesidad de fijación de la muestra de mano de obr…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen Purdue Bindley Bioscience Center imagen facilidad para acceder al microscopio confocal de escaneo láser y para el apoyo técnico, y los autores aprecian la ayuda de Andy Schaber en las instalaciones de la proyección de imagen de Bindley de Purdue. Esta actividad fue financiada por la Universidad de Purdue como parte del cruce de AgSEED fondos para apoyar la agricultura y Desarrollo Rural de Indiana.
Materials
| Agar Phyto | Dot Scientific Inc. | DSA20300-1000 | |
| Agarose | Dot Scientific Inc. | AGLE-500 | |
| Forceps | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices. |
| LSM 880 Upright Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog MS medium | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 water dipping lens | Zeiss | ||
| Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm | CELLTREAT Scientific Products | 229694 | Use as making MS plates |
| Plastic petri dishes60 mm X 15 | CELLTREAT Scientific Products | 229665 | Use as imaging dishes |
| Propagation Mix | Sungro Horticulture | ||
| Propidium iodide | Acros Organics | 440300250 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| Razor blade | PERSONNA | 62-0179 | For cutting shoot apex from plants |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Tissue | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | Image acquisition software |
Referencias
- Meyerowitz, E. M. Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell. 88 (3), 299-308 (1997).
- Xu, C., et al. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato. Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).
- Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus. Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).
- Je, B. I., et al. Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits. Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).
- Ping, J., et al. Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean. Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).
- Vaughan, J. G., Jones, F. R. Structure of the angiosperm inflorescence apex. Nature. 171, 751 (1953).
- Sijacic, P., Liu, Z. Novel insights from live-imaging in shoot meristem development. Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).
- Tax, F. E., Durbak, A. Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems. Plant Cell. 18 (6), 1331 (2006).
- Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem. Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).
- Prunet, N. Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers. Journal of Visualized Experiments. (122), e55156 (2017).
- Prunet, N., et al. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Biología del desarrollo. 419, 114-120 (2016).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131, 4225-4237 (2004).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 773 (2017).
- Zhou, Y., et al. HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers. Science. 361 (6401), 502-506 (2018).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases. Development. 142 (6), 1043 (2015).
- Li, W., et al. LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation. Science Signaling. 6 (270), ra23 (2013).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
