בתחומי החוץ והאי של האבנים הנוזומטיות
Summary
אוביקווינציה היא שינוי פוסט-טרנסלייתי המשחק תפקידים חשובים בתהליכים סלולריים והוא מתואם באופן הדוק על ידי דאובינציה. פגמים בשתי התופעות מתחת לפתווגיות אנושיות. אנו מספקים פרוטוקולים לביצוע התגובה אוביקווינציה ותגובת דאוביטיות באמצעות רכיבים מטוהרים.
Abstract
אוביקווינציה היא שינוי פוסט-טרנסלייתי, שמנגן תפקידים חשובים במסלולי איתות שונים, והוא מעורב בעיקר בתיאום תפקוד כרומטין ותהליכים הקשורים ל-DNA. שינוי זה כולל פעולה רציפה של אנזימים מספר כולל E1 אוביקוויב-הפעלה, E2 אוביקוויב-מעלה-מעלה ו-E3 אוביקוויב-ligase והוא הפוך על ידי דאוביטיות (DUBs). אוביקווינציה גורמת השפלה של חלבונים או שינוי של פונקציית החלבון כולל אפנון של פעילות אנזימטית, חלבון-חלבון אינטראקציה ולוקליזציה subcellular. צעד קריטי להפגין אוביקוויטיות חלבון או דאובינציה היא לבצע תגובות מחוץ לחומרים עם רכיבים מטוהרים. התגובות אוביקוויטיות יעיל והתגובה הדו יכול להיות מושפע מאוד על ידי רכיבים שונים המשמשים, האנזים שיתוף גורמים, מאגר תנאים, ואת האופי של המצע. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים צעד אחר צעד לניהול אוביקווינציה ותגובות דאוטיות. אנו ממחישים את התגובות הללו באמצעות רכיבים מינימליים של מתחם העכבר polycomb סרק מורכב 1 (PRC1), BMI1, ו RING1B, E3 אוביקוויב ליגאז לפני שהוא H2A על ליזין 119. דאוביטיות של נוקלאוטיז H2A מבוצע באמצעות מורכבות מינימלית של הפולימסרק (PR-דאב) המורכב על ידי האדם deubiquitinase BAP1 והמתאם הדו (דאובאד) התחום של הגורם המשותף שלה ASXL2. ניתן לנהל את הרקומביננטי האלה בהקשר של מישהו משני הצדדים בחלבונים מטוהרים בחיידקים או בנוקלאוזומים מקומיים מטוהרים מתאי מיונקים. אנו מדגישים את המורכבויות שיכולה להשפיע באופן משמעותי על תגובות אלה ואנו מציעים כי העקרונות הכלליים של הפרוטוקולים הללו יכולים להתאים במהירות ל-E3 אחרים ולליקוויטיות.
Introduction
אוביקווינציה היא אחת השינויים השכיחים ביותר שלאחר ההעברה והיא קריטית עבור מגוון רחב של אורגניזמים כולל שמרים, צמחים ובעלי חוליות. אוביקווינציה מורכבת ההחזקה הקוולנטי של אוביקוויב, 76 שמרו באופן מאוד polypeptide חומצות אמינו, כדי למקד את החלבונים ומתרחשת בשלושה צעדים רציפים מעורבים שלושה אנזימים, כלומר, E1-הפעלה, E2-מעלה מעלה ו E3 ליגאז1, 2,3. השינוי הפוסט-טרנסלייתי הזה ממלא תפקידים מרכזיים בספקטרום רחב של תהליכים ביולוגיים. אכן, E3 ליגסים, אשר לספק את הספציפיות של התגובה, מהווים משפחה גדולה של אנזימים הם האנזימים הנפוצים ביותר של מערכת אוביקוויב4,5,6. השפעות הזרם המורד של אוביקוויטיות בחלבון תלויות באופי השינוי: מונאובינציה, רב-מונאובינציה, ולינארית או מסוpolyubiquitination. לעתים נדירות משויכת השפלה פרוטאספאל, אבל במקום זה שינוי מעורב במדיגדירוג אירועים שונים איתות. Polyubiquitination מערבת את N-מסוף או שאריות ליזין ב-אוביקוויב מולקולה עצמה, ואת גורלו של חלבון polyubiquitinated תלוי שבו שאריות מעורב בשלוחה אוביקוויב שרשרת. זה כבר זמן רב ידוע כי polyubiquitination תיווך על ידי ליזין 48 של אוביקוויב מעורר השפלה פרוטאספאואל. להיפך, polyubiquitination דרך ליזין 63 של אוביקוויבאין קשורה לעתים קרובות עם הפעלת חלבון7,8,9. בדומה שינויים חשובים אחרים לאחר שלאחר ההעברה, אוביקווינציה היא הפיכה ו אוביקוויב הסרת חלבונים מובטחת על ידי פרוטסים ספציפיים כינה דאוביטיות (DUBs), אשר התפתחה כרגולטורים חשובים של תהליכים סלולריים מיכל השני , 10. חשוב, dubs רבים מאוד מתמחה, ו לווסת, באמצעות דאוביציה, מצעים ספציפיים, המציין כי איזון עדין בין אוביקווינציה ו דאוביציה הוא קריטי לתפקוד החלבון. E3s ו DUBs, יחד עם מכונות השפלה פרוטאסדום וגורמי עזר, טופס אוביקוויב פרוטאסאט מערכת (UPS, עם > 1200 גנים) אשר מווסת מסלולים איתות העיקריים, כמה מהם משויכים צמיחת התאים והתפשטות, קביעת גורל התא, בידול, תא הגירה, ומוות תאים. חשוב מכך, רגולציה של מספר אותות מפלים מעורבים אוביקווינציה מקדמת טומגנזה ומחלות נוירוניוון5,11,12,13, . ארבע עשרה
אוביקווינציה ממלאת תפקידים בביולוגיה כרומטין ותהליכים תלויי-DNA15,16,17. למשל, מונביוביטיות של היסטון H2A על ליזין 119 (להלן H2A K119ub) הוא שינוי קריטי שלאחר ההמרה מעורב הדיכוי הטרנססקריפט ותיקון DNA18,19,20, 21,22. H2A K119ub הוא מזרז על ידי מתחם מורכב של פוליקומב דכ1 (PRC1), אשר ממלאת תפקיד מרכזי בתחזוקת מידע אפיגנטי והוא שימור מאוד מ דרוזוהילה לאדם. PRC1 קאנוני הוא היווה בעיקר על ידי RING1B ו BMI1, אשר הם הליבה E3 אוביקוויב ליגאז מורכבים אחראי על האירוע הנ ל אוביקווינציה22,23. ב דרוזוהילה, H2A מונבינציה (H2A K118ub המקבילה H2A K119ub ב מחאלינים) הפוכה על ידי ה-דאב קליפסו, אשר מקיים אינטראקציה עם מסרק סקס נוסף (asx) היוצרים את קומפלקס הפוליקומב הדכאני (PR-דאב)24. משתיק היונקים של קליפסו, BAP1, הוא מדכא הגידול נמחק או מופעל ב ממאירות שונים של בני אדם25,26,27,28, בן 29 , בן 30 , מיכל בן 31 , 32 , 33. BAP1 מסדיר את התהליכים התלויים ב-DNA בגרעין ובסידן-איתות-בתיווך ואפופטוזיס ב-הרשת האנדופלזמית33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 מרכיב מערכות מרובות חלבון משנה המכילה ומווסתים שעתוק בעיקר ASXL1, ASXL2 ו ASXL3 (asxls), שלושה orthologues של asxls38,43. Asxls להשתמש במתאם דוסי ביקווינואז (דאובאד) דומיין, גם נקרא תחום asxls, כדי לעורר BAP1 דאב פעילות35,36,44. מכאן, ASXLs לשחק תפקידים חשובים בתיאום פעילות BAP1 דאב ב כרומטין ובאופן כללי יותר פונקציית מדכא הגידול שלה.
מספר שיטות קיימות כדי ללמוד אוביקווינציה ותהליכי דאובינציה. בעיקר, ביוכימיים אומר שימוש בחלבונים מטוהרים מחיידקים להישאר חזק מאוד להפגין אוביקווינציה ישירה של, או הסרת אוביקוויב מ, מצעים ספציפיים. ניתן לערוך ניסויים אלה כדי לחקור מגוון של פרמטרים כגון קביעת הדרישה של מתחמים מינימליים, קביעת מכלול התגובות הקינטיקה, הגדרת יחסי מבנה/תפקוד, והבנת ההשפעה של פתולוגי . מוטציות גנים כאן, אנו מספקים פרוטוקולים כדי לבצע אוביקווינציה ותגובות דאוטיות על מצעים כרומטין עם רכיבים מטוהרים. כמערכת מודל, בתוך מבחנה אוביקווינציה ו דאוביטיות של החלבון H2A של נוקלאוטיזומיום מוצג. חיידקים מטוהרים חלבונים התאספו במערכות מינימליות של RING1B/BMI1 ו BAP1/דאובאד משמשים עבור אוביקווינציה או דאוביטינציה של נוקלאוטיל H2A, בהתאמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר יתרונות של יצירת עמידות בפני מבחנה אוביקוויטיות ומוסר דאוביסטי לחלבונים של עניין. מאמר זה יכול לשמש ל: (i) לבסס תנאים אופטימליים ולהגדיר דרישה מינימלית לתגובות אלה, (ii) לקבוע הקבועים אנזימטית וביוכימיים (iii) להגדיר את התפקידים של קופנים או מעכבי שיכולים להשפיע על תגובות אלה, (iv) זיה?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לדיאנה אדז’נו לקבלת סיוע טכני. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים ממדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסה של קנדה (2015-2020), הגנום קוויבק (2016-2019) ו הגנום קנדה (2016-2019) כדי E.B.A. E.B.A. הוא מלומד בכיר של כפות דה לה Recherche du קוויבק-סנטרה (FRQ-S). ל-L. M ו-N.S.K. יש מלגת דוקטורט מ-FRQ-S. ה. ב. הייתה מלגת דוקטורט מהמשרד להשכלה גבוהה וממחקר מדעי של תוניסיה וקרן קול.
Materials
| Amylose agarose beads | New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
| Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
| BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| Empty chromatography column | Biorad | #731-1550 | |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
| GSH-agarose beads | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
| Ni-NTA agarose beads | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| Pore syringe filter 0.45 μm | Sarstedt | #83.1826 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
| Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
Referencias
- Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
- Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
- Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).
- Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
- Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
- Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
- Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
- Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation – the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
- Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).
- Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
- Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
- Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
- Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation. Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).
- Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
- Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
- Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
- Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
- Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
- Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
- Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
- Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
- Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
- Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
- Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
- Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
- Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
- Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
- Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
- Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
- Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
- Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
- Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
- Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385 (2018).
- Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
- Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
- Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
- Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
- Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
- Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
- Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
- Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
- Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292 (2016).
