В Vitro Увселицивание и Deubiquitination Анализы Нуклеосомальных Хистонов
Summary
Увселивание является посттрансляционной модификацией, которая играет важную роль в сотовых процессах и жестко координируется дезубикиции. Дефекты в обеих реакциях лежат в основе патологий человека. Мы предоставляем протоколы для проведения убликвитинации и реакции деубиктинации в пробирке с использованием очищенных компонентов.
Abstract
Увселицинация является пост-трансляционной модификацией, которая играет важную роль в различных сигнальных путях и особенно участвует в координации функции хроматина и днк-связанных процессов. Эта модификация включает в себя последовательное действие нескольких ферментов, включая E1 убиквитин-активизирующих, E2 убиквитин-конъюгирующие и E3 убиквитин-лигаза и вспять deubiquitinases (DUBs). Убиквитинация индуцирует деградацию белков или изменение белковой функции, включая модуляцию ферментативной активности, белково-белковое взаимодействие и субклеточную локализацию. Важным шагом в демонстрации убиквитина белка или деубиквитинации является выполнение реакций in vitro с очищенными компонентами. Эффективное убиквитивание и дезиквитинационирование реакций может быть в значительной степени влияет на различные компоненты, используемые, фермент ко-факторы, буферные условия, и характер субстрата. Здесь мы предоставляем пошаговые протоколы для проведения убиквитинации и реакции на деубиквитивание. Мы иллюстрируем эти реакции с помощью минимальных компонентов мыши Polycomb Репрессивный комплекс 1 (КНР1), BMI1, и RING1B, E3 убиквитин лигаза, что моноубиквитинат гистон H2A на лизин 119. Деубицинация нуклеосомного H2A осуществляется с использованием минимального поликомб репрессивного deubiquitinase (PR-DUB) комплекс, образованный человека deubiquitinase BAP1 и DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) домена своего кофактора ASXL2. Эти убиквитинации / deubiquitination анализы могут быть проведены в контексте либо рекомбинантных нуклеосом воссозданы с бактериями очищенных белков или родной нуклеосомы очищены от клеток млекопитающих. Мы выделяем тонкости, которые могут оказать значительное влияние на эти реакции, и предлагаем, чтобы общие принципы этих протоколов могли быть быстро адаптированы к другим убиквитинским лигазам И Дюбиквитиназа.
Introduction
Увселивание является одним из наиболее сохранимых пост-трансляционных модификаций и имеет решающее значение для широкого круга организмов, включая дрожжи, растения и позвоночных. Убиквитинация состоит из ковалентной привязанности убиквитина, высоко консервированных 76 аминокислот ный полипептид, для целевой белков и происходит в трех последовательных шагов с участием трех ферментов, т.е., E1-активизирующих, E2-конъюгии и E3 лигазы1, 2,3. Эта посттрансляционная модификация играет центральную роль в широком спектре биологических процессов. Действительно, Лигазы E3, которые обеспечивают специфику реакции, представляют собой большое суперсемейство ферментов и являются наиболее распространенными ферментами системы убиквитин4,5,6. Эффекты убиквитина белка в нистечении зависят от характера модификации: монобиквицинация, мультимонобиквитивание, линейная или разветвленная поликубиквициаляция. Монобиквитинация редко ассоциируется с протеасомальной деградацией, но вместо этого эта модификация участвует в посредничестве различных сигнальных событий. Полиубиквитинация включает в себя N-терминал или остатки лизин в самой молекуле убиквитин, и судьба полиубиквитинаированного белка зависит от того, какие остатки участвуют в расширении цепи убиквитин. Давно известно, что полиубиквитинация при посредничестве лизин 48 убиквитин вызывает протеасомальную деградацию. Напротив, полиубиквитинация через лизин 63 убиквитин часто ассоциируется с активацией белка7,8,9. Как и другие важные пост-трансляционные модификации, убиквитинация обратима, а удаление убиквитина из белков обеспечивается специфическими протеазами, называемыми deubiquitinases (DUBs), которые стали важными регуляторами клеточных процессов 2 , 10. Важно, что многие ДУБ являются узкоспециализированными, и регулировать, через deubiquitination, конкретные субстраты, указывая, что тонкий баланс между убиквитинации и деубиквитинации имеет решающее значение для функции белка. E3s и DUBs, наряду с протеаомой деградации машин и вспомогательных факторов, образуют Убиквитин Proteasome системы (UPS, с генами, с йgt;1200 генов), который регулирует основные пути сигнализации, некоторые из которых связаны с ростом клеток и пролиферации, Определение судьбы клетки, дифференциация, миграция клетки, и смерть клетки. Важно отметить, что дерегулирование нескольких сигнальных каскадов, связанных с убиквитинированием способствует опухолевому и нейродегенерационезу5,11,12,13, 14.
Убиквитинация играет всепроникающую роль в биологии хроматина и ДНК-зависимых процессах15,16,17. Например, монобиквицинирование гистона H2A на лизин 119 (далее H2A K119ub) является критической посттрансляционной модификацией, участвующей в транскрипционных репрессиях и репарации ДНК18,19,20, 21,22. H2A K119ub является катализатором Поликомб Репрессивный комплекс 1 (КНР1), который играет ключевую роль в поддержании эпигенетической информации и высоко сохраняется от drosophila к человеку. Канонические КНР1 состоит в частности, ПО RING1B и BMI1, которые являются ядром E3 убиквитин лигаза комплекса, ответственного за вышеупомянутое событие вездесущности22,23. В Drosophila, H2A монобиквицинация (H2A K118ub, который соответствует H2A K119ub у млекопитающих) меняется DUB Calypso, который взаимодействует с дополнительной секс гребень (ASX) формирования Поликомб-репрессивных DUB (PR-DUB) комплекс24. Орфога цимбаты калипсо, BAP1, является супрессор опухоли удалены или инактивированы в различных злокачественных новообразований человека25,26,27,28, 29 , 30 год , 31 год , 32 год , 33. BAP1 регулирует ДНК-зависимые процессы в ядре и кальций-сигналоцитов опосредованного апоптоза в эндоплазмической ретикулум33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 г. , 41 год , 42. BAP1 собирает многодефицитные белковые комплексы, содержащие регуляторы транскрипции, в частности ASXL1, ASXL2 и ASXL3 (ASXLs), три ортологи ASX38,43. ASXLs использовать DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) домен, также называется ДОмен ASXM, чтобы стимулировать BAP1 DUB деятельности35,36,44. Таким образом, ASXLs играют важную роль в координации активности BAP1 DUB при хроматине и в более широком смысле его функции супрессора опухоли.
Существует несколько методов изучения процессов повсеместного и деубиктивизации. Примечательно, что биохимические анализы с использованием белков, очищенных от бактерий, остаются очень мощными в демонстрации прямого убиквитина или удаления убиквитина из конкретных субстратов. Эти эксперименты могут быть проведены для изучения ряда параметров, таких как определение требования минимальных комплексов, определение кинетических реакций, определение структуры / функциональных отношений, а также понимание влияния патологических генных мутаций. Здесь мы предоставляем протоколы для проведения убиквитинации и дезюквитинационных реакций на хроматина субстратах с очищенными компонентами. В качестве модели системы представлена увселивания в пробирке и деубиктивирование нуклеосомального белка H2A. Бактерии очищенные белки, собранные в минимальных комплексах RING1B/BMI1 и BAP1/DEUBAD, используются для убликвитина или деубиктинации нуклеозомального H2A, соответственно.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько преимуществ создания надежных in vitro убиквитинации и дезиквитинации анализы для белков, представляющих интерес. Эти анализы могут быть использованы для: (i) установить оптимальные условия и определить минимальную потребность в этих реакциях, (ii) определить ферментативные…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Диану Аджауд за техническую помощь. Эта работа была поддержана грантами Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (2015-2020), Genome Квебек (2016-2019) и Genome Canada (2016-2019) Э.Б.Б.А. является старшим научным сотрудником Фонда Речерче дю Квебек-Санте (ФРЗ-С). Л.М. и Н.С.К. имеют докторскую стипендию от ФРЗ-С. Г.Б. получил докторскую стипендию от Министерства высшего образования и научных исследований Туниса и Фонда Коула.
Materials
| Amylose agarose beads | New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
| Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
| BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| Empty chromatography column | Biorad | #731-1550 | |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
| GSH-agarose beads | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
| Ni-NTA agarose beads | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| Pore syringe filter 0.45 μm | Sarstedt | #83.1826 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
| Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
Referencias
- Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
- Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
- Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).
- Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
- Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
- Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
- Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
- Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation – the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
- Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).
- Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
- Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
- Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
- Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation. Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).
- Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
- Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
- Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
- Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
- Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
- Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
- Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
- Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
- Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
- Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
- Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
- Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
- Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
- Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
- Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
- Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
- Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
- Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
- Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
- Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385 (2018).
- Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
- Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
- Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
- Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
- Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
- Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
- Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
- Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
- Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292 (2016).
