아파티닙 내성 폐 선암 종 PC-9 세포주 의 설립 및 특성은 아파티닙의 증가 복용량으로 개발
Summary
폐 선암종 PC-9 세포로부터 아파티닙 내성 세포주를 확립하는 방법이 개발되었고, 내성 세포가 특징지어졌다. 내성 세포는 비소세포 폐암 환자에게 적용되는 표피 성장인자 수용체 티로신 키나아제 억제제 내성 메커니즘을 조사하는데 사용될 수 있다.
Abstract
분자 표적 억제제에 대한 획득된 내성은 암 치료에 심각한 문제이다. 폐암은 대부분의 국가에서 암 관련 죽음의 주요 원인 남아 있습니다. 표피 성장 인자 수용체(EGFR)-활성화 돌연변이와 같은“종양발생 드라이버 돌연변이”의 발견, EGFR 티로신 키나아제 억제제(TKIs)의 분자 표적제의 후속 개발(gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib, 및 osimertinib) 최근 수십 년 동안 극적으로 변경 된 폐암 치료. 그러나, 이들 약물은 EGFR-활성화 돌연변이를 운반하는 비소세포 폐암(NSCLC)을 가진 환자에서 여전히 효과적이지 않다. 후천성 저항에 이어, NSCLC의 전신 진행은 EGFR 돌연변이 양성 NSCLC를 가진 환자 를 치료하는 데 중요한 장애물로 남아 있다. 여기서, 우리는 EGFR 엑손 19에서 EGFR 쌍 삭제의 EGFR 활성화 돌연변이를 품고 있는 NSCLC PC-9 세포로부터 3개의 독립적인 획득된 afatinib 내성 세포주를 확립하기 위한 단계적 투여량 에스컬레이션 방법을 제시한다. 3개의 독립적인 afatinib 저항 세포주를 특성화하는 방법은 간략하게 제시된다. EGFR TKIs에 대한 획득된 저항 메커니즘은 이기종이다. 따라서 EGFR-TKIs에 대한 후천성 저항성을 가진 다중 세포주를 검사해야 합니다. 10 12 개월이 단계별 복용량 에스컬레이션 접근 방식을 사용 하 여 획득 된 저항세포를 얻을 필요. 새로운 취득한 저항 기계장치의 발견은 더 효과적이고 안전한 치료 전략의 발달에 기여할 것입니다.
Introduction
5개의 티로신 키나아제 억제제, 표적표피 성장 인자 수용체(EGFR), 게피티닙, 에로티닙, 아파티닙, 다코미티닙, 및 오시메르티닙을 포함한 현재 EGFR 돌연변이 양성 비소세포 폐 환자를 치료하는데 사용할 수 있다. 암 (NSCLC). 지난 10 년간, 그 같은 환자를 위한 치료는 새로운 잠재적인 EGFR-TKIs의 발견과 극적인 발달을 겪었습니다. 폐 선암종 환자 중 EGFR의 체세포 돌연변이는 아시아인의 약 50 %와 백인 환자의 15 %에서 확인됩니다1. EGFR에서 가장 흔한 돌연변이는 EGFR 엑손(19)2에서EGFR 엑손 21 및 15 염기 쌍(bp) 삭제에서 L858R 점 돌연변이이다. NSCLC를 가진 EGFR 돌연변이 양성 환자에서, EGFR-TKIs는 백금 doublet 화학요법의이전 표준에 비해 반응 비율 및 임상 결과를 향상합니다 3.
Gefitinib 및 에로티닙은 최초로 승인된 소분자 억제제였으며 일반적으로 1세대 EGFR TKIs로 지칭된다. 이러한 EGFR TKIs는 ATP와 경쟁하여 티로신 키나아제 활성을 차단하고 ATP 결합 부위에 가역적으로 결합한다4. 아파티닙은 EGFR의 티로신 키나아제 도메인에 비가역적이고 공유적으로 결합하는 2세대 EGFR TKI이며 범인간 EGFR 패밀리 억제제5로서특징이 있다.
NSCLC를 가진 환자에 있는 이 치료의 극적인 이득에도 불구하고, 취득한 저항은 불가피합니다. 1 세대 및 2 세대 EGFR TKIs에 대한 가장 일반적인 저항 메커니즘은 EGFR exon 20에서 T790M 돌연변이의 출현이며, 이는 종양 샘플 6,7,8의50-70 %에 존재한다. 다른 저항 기전은 우회 신호 (MET, IGF1R 및 HER2), 소세포 폐암으로의 변환, 및 전임상 및 임상적으로 발생하는 상피-중간엽 전이의 유도를 포함한다. EGFR TKIs에 대한 저항 메커니즘은 이기종이다. 전임상 연구에서 새로운 내성 메커니즘을 식별함으로써, 내성을 극복하기 위해 새로운 치료법을 개발할 수 있다. 환자에게 임상적 이점을 극대화하는 최적의 서열 요법은 내성 메커니즘 및 치료 적 표적을 고려해야 한다.
그것은 모든 후속 실험의 기초이기 때문에, 올바른 부모의 세포줄을 선택하는 것이 필수적이다. 선택 전략은 임상 적 관련성으로 시작됩니다. 화학 요법과 방사선 순진한 세포줄을 선택할 필요가 있습니다. 이전 화학요법 및/또는 방사성 치료는 내성 경로의 변경 및 약물 내성 마커의 발현의 변화를 유도할 수 있다. 본 연구에서, EGFR 엑슨 19에서 15 bp 삭제를 운반하는 PC-9 세포는, afatinib에 취득한 저항의 설치를 위해 이용됩니다. 이 세포주 세포주 환자는 일본 NSCLC 환자에서 유래하였고, 이들은 이전에 화학요법과 방사선을 받지 않았다.
아파티닙은 매일 구두로 투여되기 때문에, 세포가 아파티닙의 존재 내에서 지속적으로 배양되는 체외 내 치료는 임상적으로 관련이 있을 것이다. 실험의 다양한 단계에서 사용되는 약물의 투여량은 선택된 부모 세포주에 대해 최적화되어야 한다. 세포 독성 분석법은 약물의 약물 동력학 정보와 비교되어야하는 적합한 약물 범위를 결정하는 데 사용될 수 있습니다.
선택 과정 전반에 걸쳐, 세포의 전체 집단은 단일 그룹으로 유지된다; 복제 또는 기타 분리 방법은 사용되지 않습니다. 세포는 먼저 약물의 낮은 수준에 지속적으로 노출됩니다. 이어서, 세포가 약물의 존재 속에서 성장하도록 적응한 후, 약물의 투여량은 약물의 최종 최적 용량으로 서서히 증가한다10,11. 대안적으로, 펄스 약물 투여 또는 돌연변이 발생은 약물 치료(12,13)이전에 수행되는 저항성 세포를 선택하는데 사용될 수 있다. 불행히도 약물 내성이 발병하지 않는 경우는 일반적으로 보고되지 않습니다. 선택 전략은 임상적으로 관련된 저항을 재건하기 위한 암 환자의 조건을 모방하는 것을 목표로 개발됩니다. 때로는 약물 내성의 메커니즘과 관련된 분자 변화를 식별하기 위해 높은 약물 농도가 사용됩니다. 이 모델은 임상적으로 관련성이 낮아집니다.
여기서, 우리는 EGFR 엑손(19)에서 15bp 의 탈착을 수용하는 PC-9 세포로부터 3개의 독립적인 afatinib 내성 세포주를 확립하는 방법뿐만 아니라 아파티닙 내성 세포주들의 초기 특성화를 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서, 우리는 3개의 독립적인 afatinib 저항하는 세포주를 설치하는 방법을 기술하고 부모 PC-9 세포에 비교하여 이 세포를 특징으로 합니다. 단계적으로 복용량 에스컬레이션 노출에 의해, 부모 PC-9 세포의 기간 동안 afatinib에 저항을 획득 10-12 개월. 임상적으로, EGFR TKIs에 대한 저항 기전은 이질적이며, 따라서, 아파티닙을 사용하여 초기 처리 후, PC-9 세포를 3개의 독립적인 p100 요리로 나누어 아?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
고급 암 번역 연구소 회원에게 영어 편집에 대한 그들의 사려 깊은 의견과 편집에 감사드립니다. 이 작품은 JSPS KAKENHI (교부수 : 16K09590 ~ T.Y.)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| afatinib | Selleck | S1011 | |
| anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
| bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
| cell-culture treated 10cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
| CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
| DMSO | Wako | 043-07216 | |
| ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
| GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
| NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
| Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
| protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| TBST powder | sigma | T9039 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
| 96 well microplate | Thermo | 130188 |
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