Establecimiento y caracterización de tres afatinas pulmonares resistentes a Afatinib PC-9 Líneas celulares desarrolladas con dosis crecientes de Afatinib
Summary
Se desarrolló un método para establecer líneas celulares de resistencia al afatinib a partir de células de adenocarcinoma PC-9 pulmonar, y se caracterizaron células resistentes. Las células resistentes se pueden utilizar para investigar los mecanismos de resistencia inhibidor a la tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico, aplicables a pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas.
Abstract
La resistencia adquirida a los inhibidores moleculares de la diana es un problema grave en la terapia oncológica. El cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte relacionada con el cáncer en la mayoría de los países. El descubrimiento de “mutaciones del conductor oncogénico”, comoel receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que activa mutaciones, y el desarrollo posterior de agentes moleculares dirigidos de inhibidores de la tirosina quinasa EGFR (TKI) (gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib y osimertinib) han alterado drásticamente el tratamiento del cáncer de pulmón en las últimas décadas. Sin embargo, estos medicamentos todavía no son eficaces en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) portadores de mutaciones activadoras de EGFR. Tras la resistencia adquirida, la progresión sistémica de la CPN sigue siendo un obstáculo significativo en el tratamiento de pacientes con CPENR con mutación positiva de EGFR. Aquí, presentamos un método de aumento de dosis escalonada para establecer tres líneas celulares independientes adquiridas resistentes al afatinib de células NSCLC PC-9 que albergan mutaciones activadoras por EGFR de eliminaciones de pares de 15 bases en el exón 19 del EGFR. Se presentan brevemente métodos para caracterizar las tres líneas celulares independientes de resistencia a los afatinib. Los mecanismos de resistencia adquiridos a los TKI del EGFR son heterogéneos. Por lo tanto, deben examinarse varias líneas celulares con resistencia adquirida a EGFR-TKIs. Se requieren de diez a doce meses para obtener líneas celulares con resistencia adquirida utilizando este enfoque de escalamiento de dosis escalonada. El descubrimiento de nuevos mecanismos de resistencia adquirida contribuirá al desarrollo de estrategias terapéuticas más eficaces y seguras.
Introduction
Cinco inhibidores de la tirosina quinasa, dirigidos al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), incluyendo gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib y osimertinib están actualmente disponibles para el tratamiento de pacientes con EGFR-positivo no pequeño pulmón de células (NSCLC). Durante la última década, las terapias para estos pacientes han experimentado un desarrollo dramático con el descubrimiento de nuevos potenciales EGFR-TKIs. Entre los pacientes con adenocarcinoma pulmonar, se identifican mutaciones somáticas en el EGFR en aproximadamente el 50% de los pacientes asiáticos y el 15% de los pacientes caucásicos1. Las mutaciones más comunes en EGFR son una mutación de punto L858R en las eliminaciones del par de pares de base (bp) del EGFR en el exon 192de EGFR. En pacientes con mutación positiva eg-egFR con CPN, EGFR-TKIs mejoran las tasas de respuesta y los resultados clínicos en comparación con el estándar anterior de quimioterapia doble platino3.
Gefitinib y erlotinib fueron los primeros inhibidores de moléculas pequeñas aprobados y generalmente se denominan “TKIs EGFR de primera generación”. Estos TKIs de EGFR bloquean la actividad de la tirosina quinasa compitiendo con ATP y enlazando de forma reversible a los sitios de enlace de ATP4. Afatinib es un EGFR TKI de segunda generación que se une irreversible y covalentemente al dominio de la tirosina quinasa de EGFR y se caracteriza como un inhibidor de la familia EGFR panhumano5.
A pesar del beneficio dramático de estas terapias en pacientes con CPNC, la resistencia adquirida es inevitable. El mecanismo de resistencia más común contra los TTI EGFR de primera y segunda generación es la aparición de la mutación T790M en el exon 20 del EGFR, que está presente en el 50-70% de las muestras tumorales6,7,8. Otros mecanismos de resistencia incluyen señales de bypass (a MET, IGF1R y HER2), transformación al cáncer de pulmón de células pequeñas,e inducción de la transición epitelial a mesenquimal, que se producen preclínica y clínicamente 9. Los mecanismos de resistencia a los TKI del EGFR son heterogéneos. Mediante la identificación de nuevos mecanismos de resistencia en estudios preclínicos, puede ser posible desarrollar nuevas terapias para superar la resistencia. Las terapias de secuencia óptimas que maximizan el beneficio clínico para los pacientes deben tener en cuenta los mecanismos de resistencia y la diana terapéutica.
Es imperativo elegir la línea celular parental correcta, ya que es la base de todos los experimentos posteriores. Las estrategias de selección comienzan con relevancia clínica; es necesario elegir una línea celular ingenua de quimioterapia y radiación. El tratamiento quimioterapéutico y/o radiativo previo puede inducir la alteración de las vías de resistencia y los cambios de la expresión de marcadores de resistencia a los medicamentos. En este estudio, las células PC-9, que transportan eliminaciones de 15 bp en el exón 19 de EGFR, se emplean para el establecimiento de resistencia adquirida a afatinib. Esta línea celular se deriva de un paciente japonés de CpCLC, que no recibió quimioterapia y radiación previas.
Debido a que afatinib se administra por vía oral a diario, el tratamiento in vitro continuo, donde las células se cultivan constantemente en presencia de afatinib sería clínicamente relevante. La dosis de medicamentos utilizados en los diversos pasos del experimento debe optimizarse para la línea celular parental seleccionada. Se puede utilizar un ensayo de citotoxicidad para determinar un rango de fármacos adecuado, que debe ser comparable a la información farmacocinética del medicamento.
A lo largo del proceso de selección, toda la población de células se mantiene como un solo grupo; no se utilizan clonación u otros métodos de separación. Las células se exponen primero continuamente a un nivel bajo de la droga. Posteriormente, después de que las células se adaptan para crecer en presencia de la droga, la dosis de la droga se incrementa lentamente a la dosis óptima final de la droga10,11. Alternativamente, se puede utilizar un pulso de administración de fármacos o mutagénesis para seleccionar células de resistencia, que también se realizan antes del tratamiento farmacológico 12,13. Desafortunadamente, los casos en los que la resistencia a los medicamentos no se desarrollan generalmente no se notifican. Las estrategias de selección se desarrollan con el objetivo de tratar de imitar las condiciones de los pacientes de cáncer para reconstruir la resistencia clínicamente relevante. A veces, para identificar los cambios moleculares asociados con los mecanismos de resistencia a los fármacos, se utiliza una alta concentración de fármacos. Este modelo se vuelve menos relevante clínicamente.
Aquí, describimos un método para establecer tres líneas celulares independientes resistentes a afatinib a partir de células PC-9 que albergan eliminaciones de 15 bp en el exón 19 de EGFR, así como la caracterización inicial de las líneas celulares resistentes a afatinib.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos un método para establecer tres líneas celulares independientes resistentes a afatinib y caracterizamos estas células en comparación con las células pc-9 parentales. Mediante la exposición escalonada a la escalada de dosis, las células pc-9 parentales adquirieron resistencia a afatinib durante un período de 10-12 meses. Clínicamente, los mecanismos de resistencia a los TKI del EGFR son heterogéneos y, por lo tanto, después del tratamiento inicial con afatinib, las células PC-9 se dividieron …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al miembro del Advanced Cancer Translational Research Institute por sus comentarios reflexivos y Editage por su ayuda con la edición del idioma inglés. Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI (número de concesión: 16K09590 a T.Y.).
Materials
| afatinib | Selleck | S1011 | |
| anti-EGFR monoclonal antibody | cell signaling technology | 4267S | |
| bicinchoninc acid assay | sigma | B9643 | |
| cell-culture treated 10cm dish | Violamo | 2-8590-03 | |
| CELL BANKER1 | TakaRa | CB011 | cryopreservation media |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution |
| DMSO | Wako | 043-07216 | |
| ECL solution | Perkin Elmer | NEL105001EA | |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| GeneAmp 5700 | Applied Biosystems | fluorescence-based RT-PCR-detection system | |
| GraphPad Prism v.7 software | GraphPad, Inc. | a statistical software | |
| NanoDrop Lite spectrophotometer | Thermo | spectrophotometer | |
| Nonfat dry milk | cell signaling technology | 9999S | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | sigma | P5726 | |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | sigma | P0044 | |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| Power SYBR Green master mix | Applied Biosystems | SYBR Green master mix | |
| protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| QIAamp DNA Mini kit | Qiagen | 51306 | DNA purification kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | PCR purification kit | |
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| TBST powder | sigma | T9039 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell | Bio-Rad | semi-dry t4ransfer apparatus | |
| 96 well microplate | Thermo | 130188 |
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