세균성 병원체 지방산 을 막 인지질로 통합하는 연구를 위해 닭 계란 노른자에서 지단백질 입자의 분리
Summary
이 방법은 복잡한 숙주 공급원에서 세균막, 특히 황색포도상구균에외인성 지방산의 통합을 연구하기위한 프레임 워크를 제공합니다. 이를 달성하기 위해, 닭 계란 노른자및 질량 분석법을 활용하는 세균성 인지질의 후속 지방산 프로파일링에서 지단백질 입자의 농축을위한 프로토콜이 설명된다.
Abstract
황색포도상구균 및 그밖 그람 양성 병원체는 막 인지질로 환경에서 지방산을 통합합니다. 감염 도중, 외인성 지방산의 대다수는 호스트 지단백질 입자 내의 존재합니다. 불확실성은 숙주 지방산의 저장소와 박테리아가 지단백질 입자에서 지방산을 추출하는 메커니즘에 관해서는 남아 있습니다. 이 작품에서는 닭 달걀 노른자에서 저밀도 지단백 (LDL) 입자를 농축하고 LDL이 S. 아우레우스의지방산 저장소역할을 하는지 여부를 결정하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 편견없는 지질 분석과 닭 LDL을 악용, LDL과 박테리아 사이의 상호 작용의 탐구를위한 효과적이고 경제적 인 모델. LDLs에서 외인성 지방산의 S. 아우레우스 통합의 분석은 박테리아의 지방산 조성의 특성화를 가능하게 하는 고분해능/정확한 질량 분광법 및 탠덤 질량 분광법을 사용하여 수행됩니다. LLDLs에 노출시 세균막 지질에서 발생하는 지방산의 새로운 조합의 막과 편견 없는 식별. 이러한 고급 질량 분석 기술은 인지질에 통합된 특정 외인성 지방산을 밝혀지방산 혼입의 비교할 수 없는 관점을 제공합니다. 여기에 설명 된 방법은 다른 세균성 병원체 와 복잡한 지방산의 대체 소스의 연구에 적응할 수 있습니다.
Introduction
메티실린 내성 S. 아우레우스(MRSA)는 헬스케어 관련 감염의 주요 원인이며 관련 항생제내성은 상당한 임상적 과제1,2,3이다. 따라서 새로운 치료 전략의 개발이 높은 우선 순위입니다. 그람 양성 병원체에 대한 유망한 치료 전략은 지방산 합성을 억제하는 것입니다, 막 인지질 생산을위한 요구 사항, S. 아우레우스에서,인산 을 포함 (PG),리실 -PG, 및 심장 리핀 4. 박테리아에서, 지방산 생산은 진핵 대응과 상당히 다른지방산 합성 II 통로 (FASII) 5를 통해 발생하며, FASII를 항생제 개발을위한 매력적인 표적으로 만들기5,6 . FASII 억제제는 주로 지방산 탄소 사슬 신장에 필요한 효소인 FabI를 표적으로7. 이 파비 억제제 트리클로산은 소비재 및의료기기 8,9에광범위하게 사용된다. S. 아우레우스 감염 의 치료를 위한 여러 제약 회사에 의해 추가 FabI 억제제가 개발되고 있다10,11, 12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. 그러나, S. 아우레우스를포함한 많은 그람 양성 병원체는 인지질 합성을 위한 외인성 지방산을 청소할 수 있으며, FASII 억제를 우회하여27,28,29. 따라서, FASII 억제제의 임상적 잠재력은 숙주 지방산의 공급원및 병원체가 숙주27,28로부터지방산을 추출하는 메커니즘에 대한 우리의 지식에 상당한 차이로 인해 논의된다. 이러한 격차를 해소하기 위해 지단백질 입자에서 외인성 지방산이 S. 아우레우스의막 인지질에 통합되는 것을 모니터링하는 편견없는 지질 분석 방법을 개발했습니다.
패혈증 동안, 숙주 지단백질 입자는 대부분의 숙주 지방산이 입자(30)와 연관됨에 따라, 혈관 내 숙주유래 지방산의 잠재적인 공급원을 나타낸다. 지단백질은 중성지방과 콜레스테롤 에스테르31의소수성 코어를 둘러싸는 인지질과 단백질로 구성된 친수성 껍질로 구성됩니다. 지단백질의 4개의 주요 종류 – chylomicron, 아주 저밀도 지단백, 고밀도 지단백 및 저밀도 지단백 (LDL)-는 지질 수송 차량으로 호스트에 의해 생성되고, 지방산과 콜레스테롤을 전달합니다 혈관을 통해 세포를 숙주. LDL은 트리글리세라이드와 콜레스테롤 에스테르 를 포함한 에스테르화 지방산이 풍부하다31. 우리는 이전에 고도로 정제된 인간 LDL이 PG 합성을 위한 외인성 지방산의 실행 가능한 근원이다는것을, 따라서 FASII 억제제 우회(32)를 위한 기계장치를 제공한다는 것을 입증했습니다. 인간 LDL을 정화하는 것은 기술적으로 어렵고 시간이 많이 소요될 수 있으며, 정제된 인간 LDL의 상업적 공급원은 일상적으로 사용하거나 대규모 세균 성 스크린을 수행하는 데 엄청나게 비쌉합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 지단백질 입자(33)의 풍부한 공급원인 닭달걀 노른자로부터LDL을 농축하는 절차를 수정했습니다. 우리는 성공적으로 S. 아우레우스32의막에 인간 LDL 파생 된 지방산의 혼입을 모니터링하기 위해 비표적, 고분해능 / 정확한 질량 분석및 탠덤 질량 분석법을 사용했다. 이전에 보고된 방법과는 달리, 이 접근법은 3가지 주요 포도상 구균 인지질 유형에 대해 각각의 개별 지방산 이성미를 정량화할 수 있다. 올레산(18:1)은 S. 아우레우스 인지질29,30,32에쉽게 통합되는 모든 숙주 지단백질 입자 내에 존재하는 불포화 지방산이다. S. 아우레우스는 올레산합성(29)을할 수 없다; 따라서, 인지질 통합 올레산의 양은 포도상 구균 막(29)내에서 숙주 지단백질 유래 지방산의 존재를 확립한다. 이러한 인지질 종은 여기에 기술된 최첨단 질량 분석 법에 의해 식별될 수 있으며, 지방산 공급원의 존재 상태에서 배양된 S. 아우레우스의 막 조성에 대한 전례 없는 분해능을 제공할 가능성이 높습니다. 감염 중 만남.
Protocol
Representative Results
Discussion
S. 아우레우스는 외인성 지방산을 막 인지질27,32,43에통합합니다. 외인성 지방산을 이용한 인지질 합성은 FASII 억제를 우회하지만 또한 막27,32,44의생물물리학적 특성을 변화시킵니다. 그람 양성 병원균의 인지질에 외인성 지방산을 혼입시키는 것은 ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고와이 작품의 지원에 대한 비판적 평가에 대한 해머 연구소의 회원들에게 감사드립니다. 콜로라도 의과 대학의 알렉스 호스윌 박사는 친절하게 AH1263을 제공했습니다. 미시간 주립 대학의 크리스 워터스 박사는 시약을 제공했습니다. 이 작품은 미국 심장 협회 보조금 16SDG30170026 및 미시간 주립 대학에 의해 제공 된 창업 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Ammonium sulfate | Fisher | BP212R-1 | ≥99.5% pure |
| Cell culture incubator | Thermo | MaxQ 6000 | |
| Centrafuge | Thermo | 75-217-420 | Sorvall Legen XTR, rotor F14-6×250 LE |
| Costar assay plate | Corning | 3788 | 96 well |
| Filter paper | Schleicher & Schuell | 597 | |
| Large chicken egg | N/A | N/A | Common store bought egg |
| Microplate spectrophotometer | BioTek | Epoch 2 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| S. aureus strain AH1263 | N/A | N/A | Provided by Alex Horswill of the University of Colorado |
| Dialysis tubing | Pierce | 68700 | 7,000 MWCO |
| Tryptone | Becton, Dickison and Company | 211705 | |
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24B | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A4561 | |
| Chloroform (reagent grade) | Fisher | MCX10559 | |
| Isopropanol (LC-MS grade) | Fisher | A4611 | |
| Dimyristoyl phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850345C-25mg | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | ≥99.5% pure |
| Ammonium formate | Sigma | 70221-25G-F | |
| Xcalibur software | Thermo Scientific | OPTON-30801 | |
| LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Scientific | high resolution/accurate mass MS | |
| Agilent 1260 capillary HPLC | Agilent | ||
| SpeedVac Vacuum Concentrators | Thermo Scientific |
Referencias
- Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
- Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
- Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
- Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
- Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
- Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
- Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
- Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
- Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
- Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
- Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
- Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
- Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
- Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
- Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
- Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
- Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
- Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
- Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
- Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
- Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
- Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
- Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
- Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
- Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
- Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
- Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
- Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
- Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
- Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
- Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
- Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
- Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
- Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
- Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
- Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
- Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
- Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
- Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
- Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
- Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
- Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
- Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
- Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
- Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
- Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
- Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts – Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
- Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
- Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).
