Isolação de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha para o estudo da incorporação do ácido gordo do micróbio patogénico bacteriano em phospholipids da membrana

Summary

Este método fornece um quadro para estudar a incorporação de ácidos graxos exógenos de fontes hospedeiras complexas em membranas bacterianas, particularmente Staphylococcus aureus. Para conseguir isto, os protocolos para o enriquecimento de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha e do perfil de ácido gordo subseqüente de fosfolipídios bacterianos que utilizam a espectrometria maciça são descritos.

Abstract

Staphylococcus aureus e outros patógenos gram-positivos incorporam ácidos graxos do ambiente em fosfolipídios de membrana. Durante a infecção, a maioria dos ácidos graxos exógenos estão presentes dentro de partículas de lipoproteínas hospedeiras. A incerteza permanece quanto aos reservatórios de ácidos graxos hospedeiros e os mecanismos pelos quais as bactérias extraem ácidos graxos das partículas de lipoproteínas. Neste trabalho, descrevemos protocolos de enriquecimento de partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL) da gema de ovo de frango e determinando se os LDLs servem como reservatórios de ácidos graxos para S. aureus. Este método explora análise lipidomica imparcial e LDLs de frango, um modelo eficaz e econômico para a exploração de interações entre LDLs e bactérias. A análise da integração de S. aureus de ácidos graxos exógenos de LDLs é realizada utilizando espectrometria de massas de alta resolução/acurada e espectrometria de massas em tandem, possibilitando a caracterização da composição de ácidos graxos da bactéria membrana e identificação imparcial de combinações novas de ácidos gordos que se levantam em lipídios bacterianos da membrana em cima da exposição aos LDLs. Estas técnicas avançadas da espectrometria maciça oferecem uma perspectiva incomparável da incorporação do ácido gordo revelando os ácidos gordos exógenos específicos incorporados nos phospholipids. Os métodos aqui descritos são adaptáveis ao estudo de outros patógenos bacterianos e fontes alternativas de ácidos graxos complexos.

Introduction

S. aureus resistente à meticilina (MRSA) é a principal causa de infecção associada à saúde e a resistência antibiótica associadaé um desafio clínico considerável^1,2,3. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas é uma prioridade alta. Uma estratégia de tratamento promissora para patógenos gram-positivos está inibindo a síntese de ácidos graxos, uma exigência para a produção de fosfolipídios de membrana que, em S. aureus, inclui fosfatidilglicerol (PG), lysyl-PG e cardiolipina⁴. Em bactérias, a produção de ácidos graxos ocorre através da via de síntese de ácidos graxos II (fasii)⁵, que é consideravelmente diferente da contraparte eucariótica, tornando fasii um alvo atrativo para o desenvolvimento de antibióticos^5,6 . Os nervos inibidores de FASII primeiramente alvo FabI, uma enzima exigida para o alongamento da corrente do carbono do ácido gordo⁷. O inibidor da Fabi Triclosan é amplamente utilizado em bens de consumo e de saúde^8,9. Inibidores adicionais de Fabi estão sendo desenvolvidos por diversas empresas farmacêuticas para o tratamento da infecçãopor S. aureus ^{10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26}. No entanto, muitos patógenos gram-positivos, incluindo S. aureus, são capazes de eliminar os ácidos graxos exógenos para a síntese de fosfolipídios, contornando a inibição do fasii^27,28,29. Assim, o potencial clínico dos inibidores do fasii é debatido devido a lacunas consideráveis em nosso conhecimento sobre as fontes de ácidos graxos hospedeiros e os mecanismos pelos quais os patógenos extraem ácidos graxos do hospedeiro^27,28. Para abordar essas lacunas, desenvolvemos um método de análise lipidomica imparcial para monitorar a incorporação de ácidos graxos exógenos de partículas de lipoproteínas em fosfolipídios de membrana de S. aureus.

Durante a sepse, as partículas de lipoproteínas hospedeiras representam uma fonte potencial de ácidos graxos derivados do hospedeiro dentro da vasculatura, pois a maioria dos ácidos graxos hospedeiros está associada às partículas³⁰. As lipoproteínas consistem em um escudo hidrófilo composto de fosfolipídios e proteínas que envolvem um núcleo hidrofóbico de triglicerídeos e ésteres de colesterol³¹. Quatro classes principais de lipoproteínas–chylomicron, lipoproteína muito de baixa densidade, lipoproteína de alta densidade, e lipoproteína de baixa densidade (LDL)-são produzidos pelo hospedeiro e funcionam como veículos de transporte lipídico, entregando ácidos graxos e colesterol de e para células hospedeiras através da vasculatura. Os LDLs são abundantes em ácidos graxos esterificados, incluindo triglicerídeos e ésteres de colesterol³¹. Nós temos demonstrado previamente que os LDLs humanos altamente purified são uma fonte viável de ácidos gordos exógenos para a síntese do PG, assim fornecendo um mecanismo para o desvio³²do inibidor de fasii. As LDLs humanas purificantes podem ser tecnicamente desafiadoras e demoradas, enquanto as fontes comerciais de LDLs humanas purificadas são proibitivamente caras de usar em uma base rotineira ou para realizar telas bacterianas em grande escala. Para abordar estas limitações, nós modificamos um procedimento para o enriquecimento de LDLs da gema de ovo da galinha, uma fonte rica de partículas do lipoproteína³³. Nós usamos com sucesso a espectrometria maciça unalvejada, de alta resolução/exata e a espectrometria maciça em tandem para monitorar a incorporação de ácidos gordos LDL-derivados humanos na membrana de S. aureus³². Ao contrário dos métodos previamente relatados, esta aproximação pode quantificar isómeros individuais do ácido gordo para cada um dos três tipos estafilocócica principais do fosfolipídeo. O ácido oleico (18:1) é um ácido graxo insaturado presente em todas as partículas de lipoproteínas hospedeiras que é prontamente incorporada aos fosfolipídeos de S. aureus ^29,30,32. S. aureus não é capaz de síntese de ácido oleico²⁹; Portanto, a quantidade de ácido oleico incorporado ao fosfolipídios estabelece a presença de ácidos graxos derivados da lipoproteína hospedeira dentro da membrana estafilocócica²⁹. Estas espécies de fosfolípidos podem ser identificadas pelo método de espectrometria de massas de última geração descrito aqui, oferecendo uma resolução sem precedentes da composição da membrana de S. aureus cultivada na presença de uma fonte de ácidos graxos que provavelmente encontros durante a infecção.

Protocol

Nota: o seguinte protocolo para enriquecimento de partículas de LDL da gema de ovo de galinha é derivado de Moussa et al. 200233. 1. preparação de gema de ovo de galinha para enriquecimento de partículas de LDL Sanitize dois ovos de galinha grandes lavando as conchas com 70% de solução de etanol e deixe secar ao ar. Sanitize o separador de ovo usando 70% solução de etanol e deixe secar ao ar. Prenda o separador de ovos no lábio de uma taça…

Representative Results

O protocolo para o enriquecimento de LDL da gema de ovo de galinha é ilustrado na Figura 1. Este processo começa por diluir a gema de ovo inteira com soro fisiológico e separar os sólidos de gema de ovo referidos como grânulos da fração solúvel ou plasmática contendo os LDLs (Figura 1)33. O teor de LDL da fração plasmática é ainda mais enriquecido pela precipitação do ~ 30-40 kDa β-livetins…

Discussion

S. aureus incorpora ácidos graxos exógenos em seus fosfolipídios de membrana^27,32,43. A síntese de fosfolipídios usando ácidos graxos exógenos ignora a inibição do fasii, mas também altera as propriedades biofísicas da membrana^27,32,44. Embora a incorporação de ácidos graxos exógenos em fosfolipídios de patógen…

Materials

Ammonium sulfate	Fisher	BP212R-1	≥99.5% pure
Cell culture incubator	Thermo	MaxQ 6000
Centrafuge	Thermo	75-217-420	Sorvall Legen XTR, rotor F14-6×250 LE
Costar assay plate	Corning	3788	96 well
Filter paper	Schleicher & Schuell	597
Large chicken egg	N/A	N/A	Common store bought egg
Microplate spectrophotometer	BioTek	Epoch 2
NaCl	Sigma	S9625
S. aureus strain AH1263	N/A	N/A	Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing	Pierce	68700	7,000 MWCO
Tryptone	Becton, Dickison and Company	211705
0.5 mm zirconium oxide beads	Next Advance	ZROB05
Bullet Blender	Next Advance	BBX24B
Methanol (LC-MS grade)	Fisher	A4561
Chloroform (reagent grade)	Fisher	MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade)	Fisher	A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine	Avanti Polar Lipids	850345C-25mg
Ammonium bicarbonate	Sigma	9830	≥99.5% pure
Ammonium formate	Sigma	70221-25G-F
Xcalibur software	Thermo Scientific	OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer	Thermo Scientific		high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC	Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators	Thermo Scientific