Elektrophysiologische Untersuchungen der Retinogeneulate und Corticogeniculate Synapse-Funktion
Summary
Hier stellen wir Protokolle zur Herstellung von akuten Hirnscheiben vor, die den lateralen Geniculate-Kern enthalten, und die elektrophysiologische Untersuchung der Funktion retinogenes und kortikogener Synapsen. Dieses Protokoll bietet eine effiziente Möglichkeit, Synapsen mit der hohen Freisetzungs- und Low-Release-Wahrscheinlichkeit in den gleichen akuten Gehirnscheiben zu untersuchen.
Abstract
Der laterale Geniculate-Kern ist die erste Relaisstation für die visuelle Information. Relay-Neuronen dieses thalamischen Kerns integrieren Deninput aus retinalen Ganglienzellen und projizieren sie auf den visuellen Kortex. Darüber hinaus erhalten Relaisneuronen eine Top-Down-Erregung aus dem Kortex. Die beiden wichtigsten erregerten Eingänge zu den Relaisneuronen unterscheiden sich in mehreren Aspekten. Jedes Relaisneuron erhält Deninput von nur wenigen retinogenen Synapsen, die große Terminals mit vielen Freisetzungsstellen sind. Dies spiegelt sich in der vergleichsweise starken Anregung wider, die die Relaisneuronen von retinalen Ganglienzellen erhalten. Corticogeniculate Synapsen, im Gegensatz dazu, sind einfacher mit wenigen Freisetzungsstellen und schwächere synaptische Stärke. Die beiden Synapsen unterscheiden sich auch in ihrer synaptischen kurzfristigen Plastizität. Retinogene Synapsen haben eine hohe Freisetzungswahrscheinlichkeit und zeigen daher eine kurzfristige Depression. Im Gegensatz dazu haben kortizogene Synapsen eine geringe Freisetzungswahrscheinlichkeit. Corticogeniculate Fasern durchqueren die retikulären thalamischen Kerne, bevor sie in den lateralen Geniculate-Kern gelangen. Die verschiedenen Positionen des retikulären thalamischen Kerns (rostral aus dem lateralen Genulatenkern) und des Optiktraktes (ventro-lateral aus dem lateralen Geniculate-Kern) ermöglichen die anregende Kortikogenesulate oder Retinogene Uuplate-Synapsen getrennt mit extrazellulären Stimulationselektroden. Dies macht den lateralen Geniculate-Kern zu einem idealen Hirnbereich, in dem zwei exzitatorische Synapsen mit sehr unterschiedlichen Eigenschaften, die auf denselben Zelltyp einwirken, gleichzeitig untersucht werden können. Hier beschreiben wir eine Methode zur Untersuchung der Aufzeichnung von Relaisneuronen und zur detaillierten Analyse der Retinogenulate- und Kortikogenen-Synapsenfunktion in akuten Hirnscheiben. Der Artikel enthält ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Erzeugung von akuten Hirnscheiben des lateralen Geniculate-Kerns und Schritte zur Aufzeichnung der Aktivität von Relaisneuronen durch separate Stimulierung des Optiktraktes und der kortizogenen Fasern.
Introduction
Relay Neuronen des lateralen Geniculate-Kerns integrieren und leiten visuelle Informationen an den visuellen Kortex weiter. Diese Neuronen erhalten exzitatorische Eingaben von Ganglienzellen über retinogene Synapsen, die den Haupterregerantrieb für Relaisneuronen darstellen. Darüber hinaus erhalten Relaisneuronen exzitatorische Eingaben von kortikalen Neuronen über kortikogene Synapsen. Darüber hinaus erhalten Relaisneuronen hemmende Inputs von lokalen Interneuronen und GABAergen Neuronen des Kerns reticularis thalami1. Der Kern reticularis thalami ist wie ein Schild zwischen Thalamus und Kortex vorhanden, so dass Fasern, die von Kortex zu Thalamus und in die entgegengesetzte Richtung projizieren, durch den Kern reticularis thalami2gehen müssen.
Retinogene in- und kortikogene Inputs weisen unterschiedliche synaptische Eigenschaftenauf 3,4,5,6,7,8. Retinogene Inputs bilden große Terminals mit mehreren Freisetzungsstellen9,10. Im Gegensatz dazu zeigen kortizogene Eingänge kleine Terminals mit Single Release-Sites7an. Darüber hinaus treiben Retinogene Synapsen effizient Aktionspotenziale von Relaisneuronen an, obwohl sie nur 5 bis 10 % aller Synapsen auf Relaisneuronen3,8,11ausmachen. Corticogeniculate Synapsen dienen dagegen als Modulator von Retinogenulatenübertragungen, indem sie das Membranpotenzial der Relaisneuronen12,13steuern.
Diese beiden wichtigsten erregenden Inputs für Relais-Neuronen sind auch funktional unterschiedlich. Ein deutlicher Unterschied ist die kurzfristige Depression von retinogenen Synapsen und die kurzfristige Erleichterung von Kortikogenen Synapsen3,5,8. Kurzfristige Plastizität bezieht sich auf ein Phänomen, bei dem sich die synaptische Stärke ändert, wenn die Synapse innerhalb eines Zeitraums von wenigen Millisekunden bis zu mehreren Sekunden wiederholt aktiv ist. Die synaptische Freisetzungswahrscheinlichkeit ist ein wichtiger Faktor, der der kurzfristigen Plastizität zugrunde liegt. Synapsen, mit einer geringen anfänglichen Freisetzungswahrscheinlichkeit, zeigen kurzfristige Erleichterungen aufgrund des Aufbaus von Ca2+ in der Presynapse und folglich eine Erhöhung der Freisetzungswahrscheinlichkeit wird bei wiederholter Aktivität beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigen Synapsen mit hoher Freisetzungswahrscheinlichkeit in der Regel eine kurzfristige Depression aufgrund der Erschöpfung der fertig enveasierbaren Vesikel14. Darüber hinaus trägt die Desensibilisierung postsynaptischer Rezeptoren zur kurzfristigen Plastizität in einigen Synapsen mit hoher Freisetzungswahrscheinlichkeitbei 8,15. Hohe Freisetzungswahrscheinlichkeit und Desensibilisierung von Rezeptoren für die Freisetzung von N-Amino-3-Hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionsäure (AMPA) tragen zur prominenten kurzfristigen Depression von Retinogenitätssynapsen bei. Im Gegensatz dazu liegt die geringe Freisetzungswahrscheinlichkeit der kurzfristigen Erleichterung von kortikogenen Synapsen zugrunde.
Bei Mäusen gelangt der Optische Trakt von der caudolateralen Stelle in den dorsalen lateralen Geniculate-Kern (dLGN), während kortizogene Fasern rostroventral in den dLGN eindringen. Der Abstand zwischen den beiden Eingängen ermöglicht die Untersuchung der individuellen Eigenschaften von zwei sehr unterschiedlichen erregerten Eingaben, die auf dieselbe Zelle einschlagen. Hier bauen wir auf einer zuvor beschriebenen Seziermethode auf und verbessern sie, bei der Retinogene und kortikogene Fasern in akuten Hirnscheiben konserviert werden3. Wir beschreiben dann die elektrophysiologische Untersuchung von Relaisneuronen und die Stimulation von Retinogenkulat- und Kortikogenulatefasern mit extrazellulären Stimulationselektroden. Schließlich stellen wir ein Protokoll zur Befüllung von Relaisneuronen mit Biocytin und anschließender anatomischer Analyse zur Verfügung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben ein verbessertes Protokoll auf der Grundlage einer zuvor veröffentlichten Methode3, die die Untersuchung der hohen Wahrscheinlichkeit der Freisetzung von Retinogenusat synapsen und geringe Wahrscheinlichkeit der Freisetzung corticogeniculate Synapsen aus der gleichen Scheibe ermöglicht. Dies ist von großer Bedeutung, da diese beiden Eingänge miteinander interagieren, um die visuelle Signalübertragung zu modulieren: Retinogene Inputs sind der Haupterregerantrieb von Relaisneuro…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des Sonderforschungsbereichs (SFB) 1134 “Functional Ensembles” (J.v.E. und X.C.) und des Forschungsstipendiums EN948/1-2 (J.v.E.) gefördert.
Materials
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC 10 USB Double patch clamp amplifier | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261-250MG | |
| CaCl2 | EMSURE | 1.02382.1000 | |
| choline chloride | Sigma-Aldrich | C1879-1KG | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CsCl | EMSURE | 1.02038.0100 | |
| Cs-gluconate | Self-prepared | Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves | |
| D-600 | Sigma-Aldrich | M5644-50MG | methoxyverapamil hydrochloride |
| D-APV | Biotrend | BN0085-100 | NMDA-receptor antagonist |
| Digital camera for microscope | Olympus | XM10 | |
| EGTA | SERVA | 11290.02 | |
| Forene | Abbvie | 2594.00.00 | isoflurane |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-1KG | |
| HEPES | ROTH | 9105.2 | |
| High Current Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A385 | |
| KCl | EMSURE | 1.04936.1000 | |
| MgCl2 | EMSURE | 1.05833.0250 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM7 | |
| Miroscope | Olympus | BX51 | |
| mounting medium | ThermoFisher Scientific | P36930 | Prolong Gold Invitrogen |
| NaCl | ROTH | 3957.1 | |
| NaH2PO4 | EMSURE | 1.06346.1000 | |
| NaHCO3 | EMSURE | 1.06329.1000 | |
| Pipette | Hilgenberg | 1807502 | |
| Puller | Sutter | P-1000 | |
| razor blade | Personna | 60-0138 | |
| Semiautomatic Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| SR 95531 hydrobromide | Biotrend | AOB5680-10 | GABAA-receptor antagonist |
Referencias
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