Investigaciones electrofisiológicas de la función de sinapsis de retinogeniculato y corticogeniculato
Summary
Aquí, presentamos protocolos para la preparación de rebanadas cerebrales agudas que contienen el núcleo de geniculado lateral y la investigación electrofisiológica de la función de sinapsis retinogénica y corticogénica. Este protocolo proporciona una manera eficiente de estudiar las sinapsis con la probabilidad de alta y baja liberación en las mismas rebanadas cerebrales agudas.
Abstract
El núcleo de geniculado lateral es la primera estación de relé para la información visual. Las neuronas de retransmisión de este núcleo talámico integran la entrada de las células ganglionares de la retina y la proyectan a la corteza visual. Además, las neuronas de relé reciben excitación de arriba hacia abajo de la corteza. Las dos entradas principales excitatorias a las neuronas de relé difieren en varios aspectos. Cada neurona de relé recibe la entrada de sólo unas pocas sinapsis retinogénicas, que son terminales grandes con muchos sitios de liberación. Esto se refleja en la excitación comparativamente fuerte, las neuronas de relé reciben, de las células ganglionarias de la retina. Las sinapsis corticogénicas, en cambio, son más simples con pocos sitios de liberación y una fuerza sináptica más débil. Las dos sinapsis también difieren en su plasticidad sináptica a corto plazo. Las sinapsis retinogénicas tienen una alta probabilidad de liberación y, en consecuencia, muestran una depresión a corto plazo. Por el contrario, las sinapsis corticogénicas tienen una baja probabilidad de liberación. Las fibras corticogénicas atraviesan los núcleos talámicos reticulares antes de entrar en el núcleo de geniculado lateral. Las diferentes ubicaciones del núcleo talámico reticular (rostrally del núcleo de geniculado lateral) y del tracto óptico (ventro-lateralmente desde el núcleo de geniculado lateral) permiten estimular las sinapsis corticogénica o retinogénicadas por separado con electrodos de estimulación extracelular. Esto hace que el núcleo de geniculado lateral sea un área cerebral ideal donde dos sinapsis excitatorias con propiedades muy diferentes que afectan al mismo tipo de célula, se pueden estudiar simultáneamente. Aquí, describimos un método para investigar la grabación de las neuronas de relé y para realizar un análisis detallado de la función de la sinapsis de retinogeniculato y corticogeniculato en rodajas cerebrales agudas. El artículo contiene un protocolo paso a paso para la generación de rebanadas cerebrales agudas del núcleo de geniculado lateral y pasos para registrar la actividad de las neuronas de relé estimulando el tracto óptico y las fibras corticogénicas por separado.
Introduction
Las neuronas de retransmisión del núcleo de geniculado lateral integran y transmiten información visual a la corteza visual. Estas neuronas reciben la entrada excitatoria de las células ganglioneras a través de sinapsis retinogénicas, que proporcionan el principal impulso excitatorio para las neuronas de relé. Además, las neuronas de retransmisión reciben entradas excitatorias de las neuronas corticales a través de sinapsis corticogénicas. Además, las neuronas de retransmisión reciben insumos inhibitorios de interneuronas locales y neuronas GABAérgicas del núcleo reticularis thalami1. El núcleo reticularis thalami está presente como un escudo entre el tálamo y la corteza de tal manera que las fibras quese proyectan desde la corteza hasta el tálamo y en la dirección opuesta deben pasar por el núcleo reticularis thalami 2.
Las entradas retinogénicas y las entradas de corticogeniculato muestran propiedades sinápticas distintas3,4,5,6,7,8. Las entradas de retinogeniculato formanterminales grandes con múltiples sitios de liberación 9,10. Por el contrario, las entradas de corticogeniculato muestran terminales pequeños con sitios de liberación única7. Además, las sinapsis retinogénicas impulsan eficientemente los potenciales de acción de las neuronas de relé a pesar de constituir sólo el 5-10% de todas las sinapsis en las neuronas de relé3,8,11. Las sinapsis corticogénicas, por otro lado, sirven como modulador de las transmisiones retinogénicas mediante el control del potencial de membrana de las neuronas de retransmisión12,13.
Estas dos entradas principales excitatorias para transmitir neuronas también son funcionalmente diferentes. Una diferencia prominente es la depresión a corto plazo de las sinapsis retinogénicas y la facilitación a corto plazo de las sinapsis de corticogeniculato3,5,8. La plasticidad a corto plazo se refiere a un fenómeno en el que la fuerza sináptica cambia cuando la sinapsis está repetidamente activa en un período de tiempo de pocos milisegundos a varios segundos. La probabilidad de liberación sináptica es un factor importante que subyace a la plasticidad a corto plazo. Las sinapsis, con una baja probabilidad de liberación inicial, muestran una facilitación a corto plazo debido a la acumulación de Ca2+ en la presinapvez y, en consecuencia, se observa un aumento en la probabilidad de liberación en la actividad repetida. Por el contrario, las sinapsis con alta probabilidad de liberación suelen mostrar depresión a corto plazo debido al agotamiento de las vesículas ya liberables14. Además, la desensibilización de los receptores postsinápticos contribuye a la plasticidad a corto plazo en algunas sinapsis de probabilidad de alta liberación8,15. Alta probabilidad de liberación y desensibilización de los receptores de ácido isozolapropionico (AMPA) de alta liberación contribuyen a la depresión prominente a corto plazo de las sinapsis retinogénicadas. Por el contrario, la probabilidad de baja liberación subyace a la facilitación a corto plazo de las sinapsis corticogénicas.
En ratones, el tracto óptico entra en el núcleo de geniculado lateral dorsal (dLGN) desde el sitio caudolateral, mientras que las fibras corticogénicas entran en el rostro dLGNventrally. La distancia entre las dos entradas permite la investigación de las propiedades individuales de dos entradas excitatorias muy diferentes que afectan a la misma celda. Aquí, nos basamos y mejoramos un método de disección descrito previamente en el que las fibras de retinogeniculato y corticogenicullato se conservan en rebanadas cerebrales agudas3. Nosotros, entonces, describimos la investigación electrofisiológica de las neuronas de relé y la estimulación de las fibras de retinogeniculato y corticogeniculato con electrodos de estimulación extracelular. Finalmente, proporcionamos un protocolo para el llenado de neuronas de relé con biocitetina y posterior análisis anatómico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Describimos un protocolo mejorado basado en un método publicado previamente3, que permite la investigación de la alta probabilidad de liberación de sinapsis retinogénicados y baja probabilidad de liberación de sinapsis corticogénicas de la misma rebanada. Esto es de gran importancia ya que estas dos entradas interactúan entre sí para modular la transmisión de la señal visual: las entradas retinogénicas son el principal impulsor excitatorio de las neuronas de relé, mientras que las entr…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo ha sido financiado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) dentro del Centro de Investigación Colaborativa (SFB) 1134 “Conjuntos Funcionales” (J.v.E. y X.C.) y la Beca de Investigación EN948/1-2 (J.v.E.).
Materials
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC 10 USB Double patch clamp amplifier | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261-250MG | |
| CaCl2 | EMSURE | 1.02382.1000 | |
| choline chloride | Sigma-Aldrich | C1879-1KG | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CsCl | EMSURE | 1.02038.0100 | |
| Cs-gluconate | Self-prepared | Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves | |
| D-600 | Sigma-Aldrich | M5644-50MG | methoxyverapamil hydrochloride |
| D-APV | Biotrend | BN0085-100 | NMDA-receptor antagonist |
| Digital camera for microscope | Olympus | XM10 | |
| EGTA | SERVA | 11290.02 | |
| Forene | Abbvie | 2594.00.00 | isoflurane |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-1KG | |
| HEPES | ROTH | 9105.2 | |
| High Current Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A385 | |
| KCl | EMSURE | 1.04936.1000 | |
| MgCl2 | EMSURE | 1.05833.0250 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM7 | |
| Miroscope | Olympus | BX51 | |
| mounting medium | ThermoFisher Scientific | P36930 | Prolong Gold Invitrogen |
| NaCl | ROTH | 3957.1 | |
| NaH2PO4 | EMSURE | 1.06346.1000 | |
| NaHCO3 | EMSURE | 1.06329.1000 | |
| Pipette | Hilgenberg | 1807502 | |
| Puller | Sutter | P-1000 | |
| razor blade | Personna | 60-0138 | |
| Semiautomatic Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| SR 95531 hydrobromide | Biotrend | AOB5680-10 | GABAA-receptor antagonist |
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