Summary

초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 면역글로불린 G N-글리칸 분석

Published: January 18, 2020
doi:

Summary

면역글로불린 G(IgG) N-글리칸은 친수성 상호작용 UPLC를 사용하는 것을 특징으로 한다. 또한, IgG N-글리칸의 구조는 명확하게 분리된다. 여기에 제시된 이 실험 방법에 대한 소개는 연구 환경에서 널리 사용될 수 있도록 한다.

Abstract

글리코믹스는 오믹스 시스템 연구의 새로운 특수 분야로, 질병 감수성, 약물 표적 발견 및 정밀 의학을 위한 차세대 바이오마커 를 발견하는 데 상당한 잠재력을 제공합니다. 대안 IgG N-glycans는 몇몇 일반적인 만성 질병에서 보고되고 임상 응용 (즉, 질병의 진단 및 예측을 위한 바이오마커)에 있는 중대한 잠재력을 가지고 제안되었습니다. IgG N-글리칸널리 친수성 상호 작용 크로마토그래피 (HILIC) 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC)의 방법을 사용하여 특징지어진다. UPLC는 재현성이 뛰어나고 상대적 정량이 높은 안정적인 검출 기술입니다. 또한, IgG N-glycan의 구조는 명확하게 분리되고, 혈장내의 글리칸 조성및 상대적 풍부도가 특징지어진다.

Introduction

인간단백질의 N-글리코실화는 일반적이고 필수적인 번역 후 변형1이며 질병의 발생 및 발병을 비교적 정확하게 예측하는 데 도움이 될 수 있다. 그 구조의 복잡성으로 인해 5,000 개 이상의 글리칸 구조가 있을 것으로 예상되며, 질병에 대한 진단 및 예측 바이오 마커로서 큰 잠재력을 제공합니다2. 면역글로불린 G(IgG)에 부착된 N-글리칸들은 IgG의 기능에 필수적인 것으로 나타났으며, IgG N-glycosylation은 프로-및 항염증 시스템 사이의 균형에 참여한다3. 차동 IgG N-glycosylation은 질병 병리학에 관여하는 소인 및 기능적 메커니즘을 모두 나타내는 질병 발달 및 진행에 관여한다. IgG N-glycosylation의 염증성 역할은 노화, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 암4와관련이 있다.

감지 기술의 개발과 함께, 형광 검출 (UPLC-FLR) 친수성 상호 작용 크로마토그래피 (HILIC) 초고성능 액체 크로마토그래피, 레이저 유도 형광을 이용한 멀티플렉스 모세관 겔 전기 영동등 은 높은 처리량 글리코믹에서 가장 널리 사용됩니다. esccence 검출 (xCGE-LIF), 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 질량 분광법 (MALDI-TOF-MS), 액체 크로마토그래피 전기 분무 질량 분석법 (LC-ESI-MS) . 이러한 방법은 낮은 유속, 불안정한 결과 및 불량 감도 특이성의 이전의단점을 극복했다5,6.

UPLC는 IgG N-glycosylation 및 특정 질병 사이의 연관성을 탐구하는 데 널리 사용됩니다 (즉, 노화7,비만8,이상지질혈증9,타입 II 당뇨병10,고혈압11,허혈성 뇌졸중12,파킨슨 병13). 위에서 언급한 다른 세 가지 방법에 비해 UPLC는다음과같은 장점을 가지고5,14. 첫째, 상대적 정량 분석 방법을 제공하고, 전체 면적 정규화를 수반하는 데이터 분석은 각 샘플의 비교성을 향상시킨다. 둘째, 장비 비용과 필요한 전문 지식이 상대적으로 적기 때문에 글리코실화 바이오마커를 임상 응용 분야로 쉽게 구현하고 변환할 수 있습니다. 여기에 제시된 UPLC에 대한 소개이므로 더 널리 사용될 수 있습니다.

Protocol

이 의정서에 포함된 모든 과목은 중국 베이징 의과대학의 윤리위원회의 승인을 받았습니다12. 서면 동의는 연구의 시작 부분에 각 과목에서 얻은. 1. IgG 격리 결합 완충제 (인산완충식염수, PBS): 1x PBS (pH = 7.4), 중화 버퍼 : 10x PBS (pH = 6.6-6.8), 용리액 : 0.1 M 포름산 (pH = 2.5), 용리액용 중화 액: 1 M 암모늄 중탄산염, 저장 버퍼 를 포함한 화학 물질을 준비하십…

Representative Results

도 1에나타낸 바와 같이, IgG N-글리칸스는 피크 위치 및 유지 시간에 기초하여 24개의 초기 IgG 글리칸 피크(GPs)로 분석되었다. N-글리칸구조는 이전 연구(표1)15에따른 질량 분석 검출을 통해 사용할 수 있다. 결과를 비교하기 위해, 각 피크의 글리칸 양을 총 통합 영역의 백분율로 표현한 총 면적 정규화가 적…

Discussion

UPLC는 상대정량분석방법5,15. 결과는 UPLC가 좋은 재현성과 상대적인 정량적 정확도를 갖춘 안정적인 검출 기술임을 나타냅니다. 각 피크의 글리칸 양은 상대값인 UPLC를 사용하여 총 통합 영역의 백분율로 표현됩니다. 상대 정량화는 시험 샘플의 비교 가능성을 향상시킵니다. 또한, 96웰 프로틴 G 플레이트는 높은 처리량 검출을 위해 한 번에 96개의 샘플로…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (81673247 및 81872682)과 호주 – 중국 협력 보조금 (NH & MRC – APP1112767 -NSFC 81561128020)의 보조금으로 지원되었습니다.

Materials

2-aminobenzamide, 2-AB Sigma, China
96-well collection plate AXYGEN
96-well filter plate Pol 0.45 um GHP
96-well monolithic plate BIA Separations
96-well plate rotor Eppendorf Co., Ltd, Germany T_1087461900
Acetic acid Sigma, China
Acetonitrile Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Ammonium bicarbonate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Ammonium formate Beijing Minruida Technology Co., Ltd.
Constant shaking incubator/rocker Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China ZWY-10313
Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column Watts technology Co., Ltd, China BEH column
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma, China
Disodium phosphate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Electric ovens Tester instruments Co., Ltd 202-2AB
Empower 3.0 Waters technology Co., Ltd, America
Ethanol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Formic acid Sigma, China
GlycoProfile 2-AB Labeling kit Sigma, China
HCl Junrui Biotechnology Co., Ltd, China
High-speed centrifuge Eppendorf Co., Ltd, Germany 5430
Igepal Sigma, China
Low temperature centrifuge Eppendorf Co., Ltd, Germany
Low temperature refrigerator Qingdao Haier Co., Ltd
Manifold 96-well plate Watts technology Co., Ltd, China 186001831
Methanol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Milli-Q pure water meter Millipore Co., Ltd, America Advantage A10
NaOH Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PH tester Sartorius Co., Ltd, Germany PB-10
Phosphate buffered saline, PBS Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Pipette Eppendorf Co., Ltd, Germany 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl
PNGase F enzyme Sigma, China
Potassium dihydrogen phosphate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Propan-2-ol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
SDS Sigma, China
Sodium chloride Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma, China
Spectrophotometer Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd B-500
Transfer liquid gun Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China 4672100
Tris Amresco, America
Ultra-low temperature refrigerator Thermo Co., Ltd, America MLT-1386-3-V; MDF-382E
Ultra-performance liquid chromatography Watts technology Co., Ltd, China Acquity MLtraPerformance LC
Vacuum Pump Watts technology Co., Ltd, China 725000604
Volatilizing machine/Dryer Eppendorf Co., Ltd, Germany T_1087461900
Vortex Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China NP-30S
Water-bath Tester instruments Co., Ltd DK-98-IIA
Weighing balance Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. MP200B

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Liu, D., Xu, X., Li, Y., Zhang, J., Zhang, X., Li, Q., Hou, H., Li, D., Wang, W., Wang, Y. Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography. J. Vis. Exp. (155), e60104, doi:10.3791/60104 (2020).

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