Valutazione In Vivo dell'efferocitosi del macrofago alveo dopo l'esposizione all'ozono
Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo per determinare se l’esposizione all’ozono, un criterio di inquinante dell’aria, imponga l’efferocitosi alveolar in vivo. Questo protocollo utilizza reagenti e tecniche di uso comune e può essere adattato a più modelli di lesione polmonare per determinare gli effetti sull’efferocitosi del macrofagio alveolar.
Abstract
L’ozono (O3)è un criterio di inquinamento atmosferico che esacerba e aumenta l’incidenza di malattie polmonari croniche. O3 esposizione è noto per indurre infiammazione polmonare, ma poco si sa per quanto riguarda come l’esposizione altera i processi importanti per la risoluzione dell’infiammazione. L’efferocitosi è un processo di risoluzione, in cui i macrofagi fagagocitizzano le cellule apoptotiche. Lo scopo di questo protocollo è quello di misurare l’efferocitosi del macrofago alveolare in seguito a una lesione polmonare e un’infiammazione polmonari indotta da O3. Sono stati descritti diversi metodi per misurare l’efferocitosi; tuttavia, la maggior parte richiede manipolazioni ex vivo. Descritto in dettaglio qui è un protocollo per misurare in vivo alveolare macrophage efferocytosis 24 h dopo l’esposizione O3, che evita la manipolazione ex vivo di macrofagi e serve come una semplice tecnica che può essere utilizzata per rappresentare con precisione le questo processo di risoluzione. Il protocollo è un metodo tecnicamente non intensivo e relativamente poco costoso che coinvolge l’inalazione di tutto il corpo O3 seguita dall’aspirazione orofanginale delle cellule apoptotiche (cioè, cellule T Jurkat) durante l’anestesia generale. L’efferocitosi del macrofago alveolar viene quindi misurata mediante la valutazione della microscopia leggera dei macrofagi raccolti dalla lavanda bronchoalveolar (BAL). L’efferocitosi viene infine misurata calcolando un indice efferocitico. Collettivamente, i metodi delineati quantificano l’attività efferocitica nel polmone in vivo, servendo anche per analizzare gli effetti negativi sulla salute di O3 o di altri insulti inalati.
Introduction
Il polmone è costantemente esposto a insulti ambientali, tra cui particolato d’aria, virus, batteri e gas ossidanti che innescano l’infiammazione polmonare1,2,3. Questi insulti possono compromettere lo scambio di gas e indurre lesioni vissutali irreversibili4,5. I macrofagi alveolar, che costituiscono circa il 95% delle cellule immunitarie presenti nei polmoni murini e umani all’omeostasi, sono regolatori critici dell’infiammazione polmonare dopo gli insulti ambientali1,2, 3,4,5. I macrofagi alveolar sono essenziali durante la difesa dell’ospite facendo agoccitizzando ed eliminando gli agenti patogeni. Recentemente, i macrofagi alveolar hanno dimostrato di promuovere l’omeostasi dei tessuti e la risoluzione dell’infiammazione attraverso l’efferocitosi6,7. L’efferocitosi è un processo fagocitico in cui i macrofagi inghiottiscono ed eliminano le cellule apoptotiche8,9,10. L’efferocitosi si traduce anche nella produzione di mediatori (ad es. IL-10, TGF-z, PGE2e ossido nitrico) che aumentano ulteriormente il processo, con conseguente risoluzione di infiammazione9,10,11 ,12,16,18. Questo processo è necessario per prevenire la necrosi secondaria e promuovere l’omeostasi dei tessuti12,13,14. Diversi studi hanno collegato l’efferocitosi alterata con varie malattie polmonari croniche, tra cui asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva, e fibrosi polmonare idiopatica8,9,15, 16,17.
O3 è un criterio di inquinante atmosferico che esacerba e aumenta l’incidenza delle malattie polmonari croniche19,20,21. O3 induce infiammazione polmonare e lesioni ed è noto per compromettere la fagocitosi del macrofago alveo di patogeni batterici22,23. Tuttavia, non è noto se O3 imponga l’efferocitosi del macrofago alveolar. Lo studio delle alterazioni indotte da O3nell’efferocitosi del macrofalo alveo fornirà una possibile comprensione di come l’esposizione possa portare all’incidenza e all’esacerbazione delle malattie polmonari croniche. Descritto di seguito è un metodo semplice per valutare l’efferocitosi del macrofago alveolare nei polmoni dei topi femminili dopo l’esposizione acuta di O3.
Il metodo delineato possiede diversi vantaggi rispetto ad altri protocolli di efferocitosi comunemente utilizzati sul campo eliminando l’uso di costosi coloranti fluorescenti, misurazioni di citometria a flusso estese e manipolazione ex vivo di macrofagi alveolar24 ,25. Inoltre, questo protocollo misura l’efferocitosi del macrofago alveolare nel contesto del microambiente polmonare, che può influenzare la funzione del macrofago.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’efferocitosi è un processo antinfiammatorio in cui i macrofagi eliminano le cellule apoptotiche e i detriti, nonché producono più mediatori antinfiammatori9,10,11,12,16 ,18. Diversi modelli di efferocitosi hanno fornito informazioni su come il macrofago sia una cellula critica nella risoluzione dell’infiammazione<sup cl…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è finanziato dal premio Walter A. Rosenblith Award e dal NIEHS R01ES028829 (a K. M. G). Ringraziamo la dott.ssa Dianne Walters (Dipartimento di Fisiologia, ECU) per la sua assistenza nell’ottenere immagini rappresentative dei macrofagi alveolar.
Materials
| Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
| BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
| Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
| Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
| Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
| Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
| Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
| Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |
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