In vivo avaliação da Efferocitose de macrófago alveolar após exposição ao ozônio
Summary
Este manuscrito descreve um protocolo para determinar se a exposição ao ozônio, um critério poluente aéreo, prejudica a efferocitose alveolar do macrófago in vivo. Este protocolo utiliza reagentes e técnicas comumente usados e pode ser adaptado a vários modelos de lesão pulmonar para determinar os efeitos sobre a efferocitose do macrófago alveolar.
Abstract
O ozônio (O3) é um critério poluente aéreo que exacerba e aumenta a incidência de doenças pulmonares crônicas. O3 exposição é conhecida por induzir a inflamação pulmonar, mas pouco se sabe sobre como a exposição altera os processos importantes para a resolução da inflamação. A eferocitose é um processo de resolução, pelo qual os macrófagos fagocitizam células apoptóticas. A finalidade deste protocolo é medir o macrófagos alveolar do macrófago que segue ferimento e inflamação do pulmão de O3-induced. Vários métodos foram descritos para medir a eferocitose; no entanto, a maioria exige manipulações ex vivo. Descrito em detalhes aqui é um protocolo para medir a efferocitose alveolar in vivo do macrófago 24 h após a exposição O3 , que evita a manipulação ex vivo de macrófagos e serve como uma técnica simples que pode ser usada para representar com precisão as perturbações em Este processo de resolução. O protocolo é um método tecnicamente não intensivo e relativamente barato que envolve O corpo inteiro O3 inalação seguido por aspiração orofaríngea de células apoptóticas (i.e., células de Jurkat T) enquanto anestesia geral. A efferocitose do macrófago alveolar é então medida pela avaliação da microscopia de luz dos macrófagos coletados do lavado broncoalveolar (BAL). A eferocitose é finalmente medida calculando-se um índice eferocítico. Coletivamente, os métodos delineados quantificam a atividade efferocítica no pulmão in vivo ao mesmo tempo que servem para analisar os efeitos negativos da saúde de O3 ou outros insultos inalados.
Introduction
O pulmão está constantemente exposto a insultos ambientais, incluindo partículas de ar, vírus, bactérias e gases oxidantes que desencadeiam a inflamaçãopulmonar 1,2,3. Esses insultos podem comprometer a troca gasosa e induzir lesão tecidual irreversível4,5. Macrófagos alveolares, queconstituem aproximadamente 95% das células imunes encontradas em pulmões murino e humano na homeostase, são reguladores críticos da inflamação pulmonar após insultos ambientais1,2, 3,4,5. Os macrófagos alveolares são essenciais durante a defesa do hospedeiro por fagocitizar e eliminar patógenos. Recentemente, os macrófagos alveolares têm demonstrado promover a homeostase tecidual e a resolução da inflamação através da efferocitose6,7. A eferocitose é um processo fagocitítico no qual os macrófagos engolem e eliminam as células apoptóticas8,9,10. A eferocitose também resulta na produção de mediadores (i.e., IL-10, TGF-β, PGE2e óxido nítrico) que aumentam ainda mais o processo, resultando na resolução da inflamação9,10,11 ,12,16,18. Esse processo é necessário para prevenir a necrose secundária e promover a homeostase tecidual12,13,14. Vários estudos têm ligado a efferocitose prejudicada com várias doenças pulmonares crônicas, incluindo asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, e fibrose pulmonar idiopática8,9,15, 16,17.
O3 é um critério poluente aéreo que exacerba e aumenta a incidência de doenças pulmonares crônicas19,20,21. O3 induz inflamação e lesão pulmonar e é conhecido por prejudicar a fagocitose alveolar de macrófagos de patógenos bacterianos22,23. No entanto, não se sabe se O3 prejudica a efferocitose alveolar do macrófago. Investigar as alterações induzidas pelo3na efferocitose de macrófago alveolar fornecerá uma visão potencial de como a exposição pode levar à incidência e exacerbação da doença pulmonar crônica. Descrito abaixo é um método simples para avaliar a efferocitose alveolar de macrófago nos pulmões de camundongos fêmeas após a exposição aguda O3 .
O método delineado possui várias vantagens sobre outros protocolos de eferocitose comumente utilizados no campo, eliminando o uso de corantes fluorescentes dispendiosos, medições extensas de citometria de fluxo e manipulação ex vivo de macrófagos alveolares24 ,25. Adicionalmente, este protocolo mede a efferocitose alveolar do macrófago no contexto do microambiente do pulmão, que pode influenciar a função do macrófago.
Protocol
Representative Results
Discussion
A eferocitose é um processo anti-inflamatório no qual macrófagos Desobstruem células e detritos apoptóticos, bem como produzem múltiplos mediadores anti-inflamatórios9,10,11,12,16 ,18. Vários modelos de eferocitose forneceram uma visão de como o macrófago é uma célula crítica na resolução da inflamação<sup c…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo é financiado pelo Health Effects Institute Walter A. Rosenblith Award e NIEHS R01ES028829 (para K. M. G). Gostaríamos de agradecer ao Dr. Dianne Walters (departamento de Fisiologia, ECU) por sua assistência com a obtenção de imagens representativas de macrófagos alveolares.
Materials
| Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
| BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
| Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
| Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
| Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
| Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
| Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
| Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |
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