Isolatie van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes met granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor uit embryonale stamcellen
Summary
Deze studie beschrijft een methode om exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes te isoleren die immuunstimulerende granulocyten macrofaagkolonie-stimulerende factoren dragen uit embryonale stamcellen.
Abstract
Embryonale stamcellen (SER’s) zijn pluripotente stamcellen die in staat zijn tot zelfvernieuwing en differentiatie in alle soorten embryonale cellen. Net als veel andere celtypen geven SER’s kleine membraanblaasjes, zoals exosomen, af aan de extracellulaire omgeving. Exosomen dienen als essentiële bemiddelaars van intercellulaire communicatie en spelen een basisrol in veel (patho)fysiologische processen. Granulocyte-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) functioneert als een cytokine om de immuunrespons te moduleren. De aanwezigheid van GM-CSF in exosomen heeft het potentieel om hun immuunregulerende functie te stimuleren. Hier werd GM-CSF stabiel overexpressie in de muriene ESC-cellijn ES-D3. Er werd een protocol ontwikkeld om hoogwaardige exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes (EV’s) te isoleren uit ES-D3-cellen die GM-CSF overexpressie geven. Geïsoleerde exosoom-verrijkte EV’s werden gekenmerkt door een verscheidenheid aan experimentele benaderingen. Belangrijk is dat aanzienlijke hoeveelheden GM-CSF aanwezig bleken te zijn in exosoom-verrijkte EV’s. Over het algemeen kunnen GM-CSF-dragende exosoom-verrijkte EV’s van SER’s functioneren als celvrije blaasjes om hun immuunregulerende activiteiten uit te oefenen.
Introduction
SER’s zijn afgeleid van het blastocyststadium van een pre-implantatie-embryo1. Als pluripotente stamcellen hebben SER’s het vermogen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in elk type embryonale cel. Vanwege hun opmerkelijke ontwikkelingspotentieel en proliferatieve capaciteit op lange termijn zijn SER’s uiterst waardevol voor biomedisch onderzoek1. De huidige onderzoeksinspanningen hebben zich grotendeels gericht op het therapeutisch potentieel van SER’s voor een verscheidenheid aan belangrijke pathologische aandoeningen, waaronder diabetes, hartaandoeningen en neurodegeneratieve ziekten2,3,4.
Van zoogdiercellen, waaronder SER’s, is bekend dat ze blaasjes met variabele grootte afgeven aan de extracellulaire omgeving, en deze EV’s bezitten veel fysiologische en pathologische functies vanwege hun rol in intercellulaire communicatie5. Onder verschillende subtypen van EV’s zijn exosomen kleine membraanblaasjes die vrijkomen uit verschillende celtypen in de extracellulaire ruimte bij fusie van intermediaire endocytische compartimenten, multivesiculaire lichamen (MWB’s), met het plasmamembraan6. Van exosomen is gemeld dat ze intercellulaire communicatie bemiddelen en zijn kritisch betrokken bij veel (patho)fysiologische processen7,8. Exosomen erven sommige biologische functies van hun eigen ouderlijke cellen, omdat exosomen biologische materialen bevatten die uit het cytosol zijn verkregen, waaronder eiwitten en nucleïnezuren. De geassocieerde antigenen of factoren die de immuunrespons specifiek voor een bepaalde ziekte stimuleren, zijn dus ingekapseld in de exosomen van bepaalde soorten cellen9. Dit maakte de weg vrij voor klinische onderzoeken naar tumor-afgeleide exosomen als een anti-kankervaccin10.
GM-CSF is een cytokine uitgescheiden door verschillende soorten immuuncellen11. Opkomend bewijs toont aan dat GM-CSF het immuunsysteem activeert en reguleert en een essentiële rol speelt in het antigeen-presenterende proces12. Een klinisch rapport suggereert bijvoorbeeld dat GM-CSF de immuunrespons op tumoren stimuleert als een vaccinadjuvans13. Verschillende gm-csf-gebaseerde kanker immunotherapie strategieën om de krachtige immuunstimulerende activiteit van GM-CSF te benutten zijn onderzocht in klinische onderzoeken14. Onder deze, een kankervaccin samengesteld uit bestraalde GM-CSF-afscheidende tumorcellen heeft enige belofte getoond bij gevorderde melanoompatiënten door cellulaire en humorale antitumorreacties en daaropvolgende necrose in uitgezaaide tumoren te induceren15.
Omdat de exosomen afgeleid van SER’s vergelijkbare biologische activiteiten hebben als de oorspronkelijke SER’s, kunnen GM-CSF-dragende exosomen van SER’s misschien functioneren als celvrije blaasjes om de immuunrespons te reguleren. In dit artikel wordt een gedetailleerde methode beschreven om hoogwaardige exosoom-verrijkte EV’s te produceren van SER’s die GM-CSF tot expressie geven. Deze exosoom-verrijkte EV’s hebben het potentieel om te dienen als immuunregulerende blaasjes om de immuunrespons te moduleren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze studie toont een zeer efficiënte methode voor het produceren van exosoom-verrijkte EV’s met het immuunstimulerende eiwit GM-CSF, dat kan worden gebruikt om de immuunmodulerende effecten van exosoom-verrijkte EV’s te bestuderen. Verschillende studies suggereren dat exosomen immuunregulerende en antitumorale functies vertonen22. Exosomen van SER’s die GM-CSF tot expressie komen, kunnen dus ook biologische activiteiten bezitten die de immuunrespons reguleren. In dit protocol werd exogene murine…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn de heer Arkadiusz Slusarczyk en Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) dankbaar voor het verkrijgen van transmissie-elektronenmicroscoopbeelden. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 en CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) en Free to Breathe Research Grant (K.Y.).
Materials
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
Referencias
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
- Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
- Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?. Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
- Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
- Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
- Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
- Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
- Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
- Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
- Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
- Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
- Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?. PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
- Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
- Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).
- Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
- Dranoff, G. GM-CSF-based cancer vaccines. Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).
- Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
- Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).
