Isolamento de vesículas extracelulares exosome enriquecidas carregando fator estimulante da colônia granulocito-macrófago de células-tronco embrionárias
Summary
Este estudo descreve um método para isolar vesículas extracelulares exosome enriquecidas carregando fatores estimulantes da colônia de granulocitos imunes de células-tronco embrionárias.
Abstract
As células-tronco embrionárias (ESCs) são células-tronco pluripotentes capazes de auto-renovação e diferenciação em todos os tipos de células embrionárias. Como muitos outros tipos de células, os ESCs liberam pequenas vesículas de membrana, como exosomos, para o ambiente extracelular. Os exosóis servem como mediadores essenciais da comunicação intercelular e desempenham um papel básico em muitos processos (patho)fisiológicos. O fator estimulante da colônia granulocito-macrófago (GM-CSF) funciona como uma citocina para modular a resposta imune. A presença de GM-CSF em exosóis tem o potencial de aumentar sua função imuno-regulatória. Aqui, GM-CSF foi expressado na linha de células ESC murina ES-D3. Um protocolo foi desenvolvido para isolar vesículas extracelulares supercelulares (EVs) de células ES-D3 superexpressas GM-CSF. EVs isolados enriquecidos com exosome foram caracterizados por uma variedade de abordagens experimentais. É importante ressaltar que quantidades significativas de GM-CSF foram encontradas presentes em EVs exosome enriquecidos. No geral, os EVs exosóicos enriquecidos por GM-CSF dos ESCs podem funcionar como vesículas livres de células para exercer suas atividades imuno-reguladoras.
Introduction
Os ESCs são derivados do estágio blastocisto de um embrião de pré-implantação1. Como células-tronco pluripotentes, os ESCs têm a capacidade de se auto-renovar e diferenciar-se em qualquer tipo de célula embrionária. Devido ao seu notável potencial de desenvolvimento e capacidade proliferativa a longo prazo, os CES são extremamente valiosos para a pesquisa biomédica1. Os esforços atuais de pesquisa têm se concentrado em grande parte no potencial terapêutico das ESCs para uma variedade de doenças patológicas graves, incluindo diabetes, doenças cardíacas e doenças neurodegenerativas2,3,4.
As células mamíferas, incluindo os ESCs, são conhecidas por liberar vesículas com tamanhos variáveis para o ambiente extracelular, e esses EVs possuem muitas funções fisiológicas e patológicas devido ao seu papel na comunicação intercelular5. Entre diferentes subtipos de EVs, exósmos são pequenas vesículas de membrana liberadas de vários tipos de células para o espaço extracelular após a fusão de compartimentos endocíticos intermediários, corpos multivesiculares (MVBs), com a membrana plasmática6. Exosomos têm sido relatados para mediar a comunicação intercelular e estão criticamente envolvidos em muitos processos (patho)fisiológicos7,8. Exosomos herdam algumas funções biológicas de suas próprias células parentais, porque exosomos contêm materiais biológicos adquiridos a partir do citosol, incluindo proteínas e ácidos nucleicos. Assim, os antígenos ou fatores associados que estimulam a resposta imune específica para uma determinada doença são encapsulados nos exossomos de determinados tipos de células9. Isso abriu caminho para testes clínicos explorando exosóis derivados de tumores como uma vacina anticâncativa10.
GM-CSF é uma citocina secretada por diferentes tipos de células imunes11. Evidências emergentes demonstram que o GM-CSF ativa e regula o sistema imunológico e desempenha um papel essencial no processo de apresentação de antígenos12. Por exemplo, um relatório clínico sugere que o GM-CSF estimula a resposta imune aos tumores como adjuvante da vacina13. Várias estratégias de imunoterapia contra o câncer baseadas em GM-CSF para explorar a potente atividade imuno-estimulante do GM-CSF têm sido investigadas em ensaios clínicos14. Entre elas, uma vacina contra o câncer composta por células tumorais irradiadas de GM-CSF tem mostrado alguma promessa em pacientes com melanoma avançado, induzindo respostas de antitumorais celulares e humorais e necrose subsequente em tumores metástases15.
Como os exosóis derivados de ESCs possuem atividades biológicas semelhantes às ESCs originais, talvez exosósmos portadores de GM-CSF de ESCs possam funcionar como vesículas livres de células para regular a resposta imune. Neste artigo, é descrito um método detalhado para produzir EVs exossome enriquecidos de alta qualidade de ESCs expressando GM-CSF. Esses EVs exosome enriquecidos têm o potencial de servir como vesículas imuno-regulatórias para modular a resposta imune.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudo mostra um método altamente eficiente de produção de EVs enriquecidos com exosomos carregando a proteína imuno-estimulante GM-CSF, que pode ser empregada para estudar os efeitos imuno-modulatórios de EVs enriquecidos com exosomos. Vários estudos sugerem que os exosóis exibem funções imuno-regulatórias e anti-tumores22. Assim, exosóis de ESCs expressando GM-CSF também podem possuir atividades biológicas que regulam a resposta imune. Neste protocolo, o exógeno murine GM-CSF …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos ao Sr. Arkadiusz Slusarczyk e à Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) por adquirir imagens de microscópio eletrônico de transmissão. Este trabalho foi apoiado em parte por subvenções do NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 e CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) e Free to Breathe Research Grant (K.Y.).
Materials
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
Referencias
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