Um protocolo da microdissecção da captação do laser (LCM) foi desenvolvido para obter a quantidade suficiente de RNA de alta qualidade para a análise da expressão de gene em pilhas de osso. O estudo atual centra-se em seções do fêmur do rato. Entretanto, o protocolo de LCM relatado aqui pode ser usado para estudar a expressão de gene nas pilhas de todo o tecido duro.
O rendimento e a integridade do RNA são decisivos para a análise do RNA. Entretanto, é frequentemente desafiante tecnicamente manter a integridade do RNA durante todo o procedimento inteiro da microdissecção da captação do laser (LCM). Desde que os estudos de LCM trabalham com baixas quantidades de material, as preocupações sobre rendimentos limitados do RNA são igualmente importantes. Conseqüentemente, um protocolo de LCM foi desenvolvido para obter a quantidade suficiente de RNA de alta qualidade para a análise da expressão de gene em pilhas de osso. Avaliou-se o efeito do protocolo de coloração, da espessura dos criossecções, da quantidade de tecido microdissecado, do kit de extração de RNA e do sistema de LCM utilizado no rendimento de RNA e na integridade Obtida de células ósseas microdissecadas. As seções congeladas oito-μm-grossas do osso foram feitas usando uma película adesiva e manchadas usando um protocolo rápido para uma mancha comercial de LCM. A amostra foi imprensada entre uma membrana de polietileno tereftalato (PET) e a película adesiva. Um sistema de LCM que usa a gravidade para a coleção da amostra e um método coluna-baseado da extração do RNA foi usado para obter o RNAs da alta qualidade do suficiente rendimento. O estudo atual centra-se em seções do fêmur do rato. Entretanto, o protocolo de LCM relatado aqui pode ser usado para estudar a expressão de gene in situ nas pilhas de todo o tecido duro em circunstâncias fisiológicas e em processos da doença.
Os tecidos são compo de tipos heterogêneos e espacialmente distribuídos da pilha. Diferentes tipos de células em um determinado tecido podem responder de forma diferente ao mesmo sinal. Portanto, é essencial ser capaz de isolar populações de células específicas para a avaliação do papel de diferentes tipos de células em condições fisiológicas e patológicas. A microdissecção de captura a laser (LCM) oferece um método relativamente rápido e preciso para isolar e remover células especificadas de tecidos complexos1. Os sistemas de LCM usam o poder de um feixe de laser para separar as pilhas do interesse das seções histológicas do tecido sem a necessidade para o processamento enzimático ou o crescimento na cultura. Isto significa que as pilhas estão em seu habitat natural do tecido, e que a arquitetura do tecido que inclui a relação Spatial entre pilhas diferentes é mantida. A morfologia das células capturadas e do tecido residual é bem preservada, e vários componentes teciduais podem ser amostrados sequencialmente a partir do mesmo slide. As células isoladas podem então ser usadas para análise subsequente de seu conteúdo de RNA, DNA, proteína ou metabólito2,3.
Para analisar a expressão gênica em diferentes populações celulares, ou após diferentes tratamentos, é necessário obter mRNAs de qualidade e quantidade suficientes para a análise subsequente4,5. Em contraste com o DNA, as RNAs são mais sensíveis à fixação e o uso de tecido congelado é recomendado quando o objetivo é estudar o RNA. Desde que os mRNAs estão degradados rapidamente por ribonucleases onipresente (RNase), as condições RNase-livres estritas durante a manipulação e a preparação do espécime e evitando o armazenamento das amostras na temperatura ambiente são exigidas. Além, as técnicas rápidas sem nenhumas etapas aquosas prolongadas da fase são cruciais impedir a degradação6do RNA. O rendimento e a integridade do RNA também podem ser afetados pelo processo de LCM e osistema deLCM utilizado7,8. Atualmente, quatro sistemas de LCM com diferentes princípios operacionais estão disponíveis2. O método da extração do RNA pode igualmente ser importante, desde que os jogos diferentes da isolação do RNA foram testados com diferenças significativas na quantidade e na qualidade do RNA7,8.
Qualquer método de preparo tecidual requer encontrar um equilíbrio entre a obtenção de bom contraste morfológico e a manutenção da integridade do RNA para análises adicionais. Para preparar seções congeladas do osso, um filme adesivo foi desenvolvido e melhorado continuamente9. As seções do osso são cortadas e manchadas diretamente na película adesiva. Esta película adesiva é aplicável a muitos tipos de mancha, e pode ser empregada para isolar as pilhas do interesse dos Cryosections do osso usando LCM9,10,11,12,13, a 14. Todos os passos, incluindo a remoção cirúrgica, incorporação, congelamento, corte e coloração pode ser concluída dentro de menos de uma hora. É importante ressaltar que células como osteoblastos, células de forro ósseo e osteoclastos podem ser claramente identificadas9,10,11,12,13,14. Este método tem a vantagem de ser rápido e simples. Um método alternativo para a geração de criossecções ósseas é o uso do sistema de transferência de fita15. No entanto, a última técnica é mais demorada e requer instrumentação adicional, uma vez que as secções têm de ser transferidas da fita adesiva para lâminas de membrana pré-revestidas por ultravioleta (UV) cross-linking. Embora o sistema de transferência de fita tenha sido acoplado com êxito com o LCM16,17,18,19, deve-se notar que o revestimento reticulado pode criar um padrão de plano de fundo que pode interferir com a identificação do tipo celular20.
Tipicamente, apenas pequenas quantidades de RNA são extraídas de células microdissecadas, e a qualidade e a quantidade de RNA são frequentemente avaliadas por eletroforese microcapilar21. Um programa de computador é usado para atribuir um índice da qualidade aos extratos do RNA chamados número da integridade do RNA (RIN). Um valor de RIN de 1,0 indica o RNA completamente degradado, visto que um valor de 10,0 sugere que o RNA esteja inteiramente intacto22. Geralmente, os índices sobre 5 são considerados suficientes para estudos do RNA. Os testes padrões da expressão de gene nas amostras com um valor de RIN de 5.0 − 10.0 foram relatados para correlacionar bem uns com os outros23. Embora a sensibilidade deste método seja elevada, uma vez que tão pouco quanto 50 PG/μL do RNA total pode ser detectado, pode ser muito difícil obter uma avaliação da qualidade se a concentração do RNA na amostra for muito baixa. Conseqüentemente, a fim avaliar a qualidade do RNA, a seção do tecido que permanece após o LCM é usada frequentemente para extrair o RNA, introduzindo com pipting o amortecedor na corrediça24.
Embora o LCM seja usado extensivamente em tecidos congelados diferentes, os valores de RIN de RNAs extraídos são relatados raramente. Além disso, não há estudos comparativos para esclarecer o método mais adequado para estudar RNA em ossos do rato. No presente estudo, foram utilizados cortes congelados de fêmures de camundongo adulto para otimizar a preparação da amostra, o protocolo de LCM e a extração de RNA para obtenção de RNAs de alta qualidade. O presente protocolo foi otimizado especialmente para o sistema de LCM que utiliza a gravidade para coleta de amostras.
Tanto a qualidade quanto a quantidade de RNA podem ser afetadas negativamente em todas as etapas da preparação da amostra, como manipulação tecidual, processo de LCM e extração de RNA. Conseqüentemente, um protocolo de LCM foi desenvolvido para obter suficiente quantidade de RNA de alta qualidade para a análise subseqüente da expressão de Gene.
Para a LCM, a maioria dos laboratórios utiliza secções 7 − 8 μm de espessura2. Seções mais grossas permitiria que mais mat…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem a UTE Zeitz e a Nikole Ginner por sua excelente ajuda técnica, bem como a Vetcore e a equipe de cuidados com animais para seu apoio.
2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
glass microscope slides, cut colour frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
PET membrane slides 1.4 mircon | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |