Характеристика влияния миграстатических ингибиторов на 3D-вторжение опухолевых сфероидов с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения

Summary

Влияние миграстатических ингибиторов на миграцию клеток рака глиомы в трехмерных (3D) инватифицированных анализах с использованием ингибитора гистона деацетилазы (HDAC) характеризуется конфокальной микроскопией высокого разрешения.

Abstract

Обнаружение и разработка лекарственных средств в исследованиях рака все чаще основывается на экранах лекарств в 3D-формате. Новые ингибиторы, нацеленные на мигрирующие и инвазивные потенциал раковых клеток, и, следовательно, метастатическое распространение болезни, в настоящее время обнаружены и рассматриваются в качестве дополнительного лечения в высокоинвазивных раковых заболеваний, таких как глиомы. Таким образом, требуется создание данных, позволяющих провести детальный анализ клеток в 3D-среде после добавления препарата. Описанная здесь методология, сочетающая анализ ысфероидов с высоким разрешением захвата изображений и анализа данных с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM), позволила детально охарактеризовать последствия потенциального антимиграционного ингибитора МИ-192 на клетках глиомы. Сфероиды были созданы из клеточных линий для анализа вторжения в низких адептов 96-колодцев, а затем подготовлены для анализа CLSM. Описанный рабочий процесс был предпочтительнее по сравнению с другими широко используемыми методами генерации сферидов из-за легкости и воспроизводимости. Это, в сочетании с улучшенным разрешением изображения, достигнутым с помощью конфокальной микроскопии по сравнению с обычными широкоугольными подходами, позволило выявить и проанализировать различные морфологические изменения в мигрирующих клетках в 3D-среде после лечение миграстатическим препаратом Ми-192.

Introduction

Трехмерные сфероидные технологии для доклинического открытия лекарственных средств и разработки потенциальных лекарств от рака все чаще отдают предпочтение по сравнению с обычными экранами лекарств; таким образом, наблюдается более развитие мигратического – миграции и предотвращения вторжения – наркотиков. Обоснование этих событий в лечении рака ясно: 3D сфероидных анализов представляют собой более реалистичный подход для скрининга потенциальных противораковых препаратов, поскольку они имитируют 3D архитектуры опухоли более точно, чем монослой культур клеток, более точно подытоживая лекарственное взаимодействие (кинетику) и позволяющий охарактеризовать активность препарата в условиях, связанных с опухолью. Кроме того, рост устойчивости к химиотоксическим препаратам во многих типах рака и высокие показатели смертности среди онкологических больных из-за метастазов, потенцяющихся благодаря способности раковых клеток мигрировать в отдаленные места опухоли, поддерживает включение химиотерапевтических агентов ориентации миграционный потенциал раковых клеток в качестве адъювантного лечения в будущих клинических испытаний рака¹. Это особенно верно при высокоинвазивных раковых заболеваниях, таких как высококачественные глиобластомы (ГБМ). GBM управление включает в себя хирургию, лучевую терапию и химиотерапию. Однако, даже при комбинированном лечении, большинство пациентов рецидива в течение 1 года с начала диагностики со средней выживаемости 11-15 месяцев^2,3. Огромные достижения в области 3D-технологий были сделаны за последние несколько лет: вращающиеся системы, микрофабрикаты структур и 3D эшафот, и другие индивидуальные анализы постоянно совершенствуются, чтобы позволить рутинное тестирование в больших масштабах^{4, 5,6,7}. Однако результаты, полученные в результате этих анализов, должны быть проанализированы значимым образом, поскольку интерпретация данных часто затрудняется попытками анализа 3D-данных с помощью 2D-систем анализа изображений.

Несмотря на предпочтительность с точки зрения скорости приобретения изображения и снижения фототоксичности, большинство широкоугольных систем остаются ограниченными резолюцией⁸. Таким образом, помимо данных считывание из-за эффективности препарата, подробное воздействие действия препарата на 3D клеточные структуры мигрирующих клеток неизбежно теряется, если наснимки с помощью широкоугольной системы. И наоборот, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) захватывает высококачественные оптически секционные изображения, которые могут быть реконструированы и представлены в 3D пост-приобретении с помощью компьютерного программного обеспечения. Таким образом, CLSM легко применим к сложным 3D-клеточным структурам, что позволяет проводить анализ воздействия антимиграстатических ингибиторов на 3D-структуры и проводить углубленный анализ механизмов миграции клеток. Это, несомненно, будет определять будущую разработку миграстатических препаратов. Здесь описан комбинированный рабочий процесс генерации сфероидов, медикаментозного лечения, протокола окрашивания и характеристики с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения.

Protocol

1. Поколение сотовых сфероидов День 1 Подготовьте стандартную среду культуры, как того требует исследуемая линия ячейки. Провести все ткани культуры связанных шагов в ткани культуры капот с использованием стерильных методов обработки. Трипсиниз…

Representative Results

Трехмерная сфероидная технология продвигает понимание лекарственно-опухолевых взаимодействий, поскольку она более репрезентативной для специфической для рака среды. Поколение сфероидов может быть достигнуто несколькими способами; в этом протоколе использовались …

Discussion

Описан новый способ создания сфероидов раковых клеток для выявления мигратической активности препарата с помощью конфокальной микроскопии с высоким разрешением. Использование низких адепт пластин над другими методами, такими как висит капель¹⁵, способствовало средства ?…

Materials

Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various – according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3ml)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
various multichannel (50 – 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.