Migrastatik İnhibitörlerin 3Boyutlu Tümör Spheroid İnvazyonu Üzerine Etkilerinin Yüksek Çözünürlüklü Konfokal Mikroskopi Ile Karakterizasyonu

Summary

Histon deasetilez (HDAC) inhibitörü kullanılarak yapılan üç boyutlu (3D) invazyon tahlillerinde migrastatik inhibitörlerin glioma kanser hücresi göçü üzerindeki etkileri yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile karakterizedir.

Abstract

Kanser araştırmalarında ilaç keşfi ve gelişimi giderek 3D formatında ilaç ekranları üzerinde kuruluyor. Kanser hücrelerinin göçmen ve invaziv potansiyelini ve dolayısıyla hastalığın metastatik yayılımını hedefleyen yeni inhibitörler, gliomas gibi yüksek invaziv kanserlerde keşfedilmekte ve tamamlayıcı tedaviler olarak kabul edilmektedir. Bu nedenle, bir ilacın eklenmesinden sonra 3Boyutlu bir ortamda hücrelerin ayrıntılı analizlerini sağlayan veri üretmek gereklidir. Burada açıklanan metodoloji, yüksek çözünürlüklü görüntü yakalama ve konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) ile veri analizi ile küresel invazyon tahlilleri birleştirerek, potansiyel anti-göçmen inhibitörü etkilerinin ayrıntılı karakterizasyonu sağladı Mi-192 glioma hücrelerinde. Sferoidler düşük yapışık 96-iyi plakalar invazyon tahlilleri için hücre hatlarından üretildi ve daha sonra CLSM analizi için hazırlandı. Açıklanan iş akışı, hem kolaylık hem de tekrarlanabilirlik nedeniyle yaygın olarak kullanılan küresel üretim tekniklerine göre tercih edilebildi. Konfokal mikroskopi ile elde edilen gelişmiş görüntü çözünürlüğü ile birlikte konvansiyonel geniş alan yaklaşımları, göçmen hücrelerdeki farklı morfolojik değişikliklerin tanımlanmasına ve analiz inanılmaktadır. migrastatik ilaç MI-192 ile tedavi.

Introduction

Preklinik ilaç keşfi ve potansiyel kanser ilaçlarının geliştirilmesi için üç boyutlu küresel teknolojiler giderek geleneksel ilaç ekranları üzerinde tercih edilmektedir; böylece, migrastatik daha fazla gelişme var – göç ve işgali önleme – uyuşturucu. Kanser tedavisindeki bu gelişmelerin ardındaki mantık açıktır: 3D küresel tahliller, 3D tümör mimarisini hücre monokatmanlı kültürlere göre daha sadık bir şekilde taklit ettikleri için potansiyel anti-kanser ilaçlarının taranması için daha gerçekçi bir yaklaşım dır. ilaç-tümör etkileşimlerini (kinetik) daha doğru bir şekilde özetler ve tümörle ilgili bir ortamda ilaç aktivitesinin karakterizasyonuna izin verir. Buna ek olarak, birçok kanser türünde kemotoksik ilaçlara karşı direncin artması ve kanser hücrelerinin uzak tümör bölgelerine göç etme yeteneği ile güçlü metastaz nedeniyle kanser hastaları arasında yüksek ölüm oranları kemoterapötik ajanların dahil edilmesini destekler gelecekteki klinik kanser çalışmalarında adjuvan tedavi olarak kanser hücrelerinin göç potansiyelini hedefleme¹. Bu durum özellikle yüksek dereceli glioblastomlar (GBM) gibi yüksek invaziv kanserlerde geçerlidir. GBM yönetimi cerrahi, radyoterapi ve kemoterapi içerir. Ancak, kombinasyon tedavisi ile bile, çoğu hasta 11-15 ay ortanca sağkalım ile ilk tanı 1 yıl içinde nüks^2,3. 3D teknolojisi alanında büyük gelişmeler son birkaç yıl içinde yapılmıştır: rotatif sistemler, mikrofabrikasif yapılar ve 3D iskeleler, ve diğer bireysel tahliller sürekli büyük ölçekli rutin test sağlamak için geliştirilmektedir^{4, 5,6,7}. Ancak, veri yorumlama genellikle 2B görüntü analiz sistemleri ile 3D oluşturulan verileri analiz girişimleri tarafından engellenir, çünkü bu tahlillerden elde edilen sonuçlar anlamlı bir şekilde analiz edilmelidir.

Görüntü edinme hızı ve azaltılmış foto-toksisite açısından tercih edilmesine rağmen, en geniş alan sistemleri çözünürlük⁸ile sınırlı kalır. Bu nedenle, uyuşturucu etkinliğiyle ilgili veri okumalarının yanı sıra, geniş alan sistemi kullanılarak görüntülendiği takdirde, uyuşturucu eyleminin göç eden hücrelerin 3B hücresel yapıları üzerindeki ayrıntılı etkileri kaçınılmaz olarak kaybolmaktadır. Buna karşılık, confocal lazer tarama mikroskobu (CLSM) bilgisayar yazılımı kullanılarak 3D satın alma sonrası yeniden inşa edilebilir ve işlenebilir yüksek kaliteli, optik kesitli görüntüler yakalar. Böylece CLSM, kompleks 3D hücresel yapıların görüntülenmesi için kolayca uygulanabilir ve böylece anti-migrastatik inhibitörlerin 3Boyutlu yapılar üzerindeki etkilerinin sorgulanmasını ve hücre geçiş mekanizmalarının derinlemesine analizlerinin incelenmesini sağlar. Bu şüphesiz gelecekteki migrastatik ilaç gelişimine rehberlik edecektir. Burada, küresel nesil kombine bir iş akışı, ilaç tedavisi, boyama protokolü, ve yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile karakterizasyon açıklanmıştır.

Protocol

1. Hücre Spheroids Üretimi 1. Gün Araştırma altındaki hücre hattının gerektirdiği standart kültür ortamını hazırlayın. Steril işleme tekniklerini kullanarak doku kültürü ile ilişkili tüm adımları bir doku kültürü başlık yürütmek. Kanser hücrelerini deneyin ve sayın. Plaka başına 20 mL hücre süspansiyonu kullanın. Hücre süspansiyonlarını açıkça etiketli steril evrensel tüplerde tutun. Her kuyu…

Representative Results

Üç boyutlu küresel teknoloji kansere özgü ortamın daha fazla temsilcisi olduğu için ilaç-tümör etkileşimleri anlayışı nı ilerletmektedir. Küresel lerin üretimi çeşitli şekillerde elde edilebilir; bu protokolde düşük yapışma 96-kuyu plakaları kullanılmıştır. Farklı üreticilerin çeşitli ürünleri test ettikten sonra, burada kullanılan plakalar sürekli başarılı küresel üretim ve tekdüzelik açısından en iyi performans çünkü seçildi. Büyüme …

Discussion

Yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanarak migrastatik ilaç aktivitesinin belirlenmesi için kanser hücresi küresel oluşturmak için yeni bir yol açıklanmıştır. Diğer teknikler üzerinde düşük yapışkan plakaların kullanımı, bu tür damla asılı¹⁵, kollajen göç ve istila tahlilleri kullanılmak üzere tekrarlanabilir ve tek tip sferoidler üreten bir araç kolaylaştırmıştır. Bu protokoldeki kritik noktalar, kollajen matrisine hücre küresel katıştırma i?…

Materials

Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various – according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3ml)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
various multichannel (50 – 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.