Rilevamento del cancro ovarico utilizzando la citometria a flusso fotoacustico
Summary
Viene presentato un protocollo per rilevare le cellule tumorali ovariche circolanti utilizzando un sistema di flusso fotoacustico su misura e nanoparticelle di solfuro di rame con cofano con clofatura di acido folico mirati.
Abstract
Molti studi suggeriscono che l’enumerazione delle cellule tumorali circolanti (CTC) può mostrare promessa come strumento prognostico per il cancro ovarico. Le strategie attuali per il rilevamento dei CTC includono la citometria di flusso, i dispositivi microfluidici e la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR). Nonostante i recenti progressi, i metodi per la rilevazione delle metastasi del cancro ovarico precoce mancano ancora della sensibilità e della specificità necessarie per la traduzione clinica. Qui, viene presentato un nuovo metodo per la rilevazione di cellule tumorali circolanti ovariche da citometria a flusso fotoacustica (PAFC) utilizzando un sistema stampato tridimensionale personalizzato (3D), tra cui una camera di flusso e una pompa di siringhe. Questo metodo utilizza nanoparticelle di solfuro di rame con controllo acido folico (FA-CuS NP) per indirizzare le cellule tumorali ovariche SKOV-3 da PAFC. Questo lavoro dimostra l’affinità di questi agenti di contrasto per le cellule tumorali ovariche. I risultati mostrano la caratterizzazione NP, il rilevamento PAFC e l’assorbimento di NP mediante microscopia a fluorescenza, dimostrando così il potenziale di questo nuovo sistema per rilevare i CTC ovarici a concentrazioni fisiologicamente rilevanti.
Introduction
Il cancro ovarico è una delle neoplasie ginecologiche più letali e ha provocato circa 184.800 decessi in tutto il mondo nel 20181. Studi multipli hanno dimostrato la correlazione tra la progressione del cancro ovarico (cioè la metastasi) e la presenza di CTC2,3,4. Il metodo più comune per il rilevamento e l’isolamento dei CTC utilizza il sistema Cellsearch, che si rivolge al recettore EpCam5. L’espressione EpCam, tuttavia, è downregolata nella transizione epiteliale a mesenchymic, che è stata implicata nella metastasi del cancro6. Nonostante i progressi compiuti, le attuali tecnologie cliniche soffrono ancora di bassa precisione, costi elevati e complessità. A causa di questi inconvenienti, le nuove tecnologie per la scoperta e l’enumerazione dei CTC ovarici sono diventate un’area importante per la ricerca.
Recentemente, il PAFC è emerso come un metodo efficace per la rilevazione non invasiva delle cellule tumorali, l’analisi dei nanomateriali e l’identificazione dei batteri7,8,9. IL PAFC differisce dalla tradizionale citometria del flusso di fluorescenza rilevando gli analiti nel flusso utilizzando la fotoacustica. L’effetto fotoacustico viene generato quando la luce laser viene assorbita da un materiale che causa l’espansione termoelastica, producendo un’onda acustica che può essere rilevata da un trasduttore ad ultrasuoni10,11. I vantaggi del PAFC rispetto ai metodi tradizionali di citometria di flusso includono semplicità, facilità di traduzione in ambienti clinici e il rilevamento di CTC a profondità senza precedenti nei campioni dei pazienti12,13. Recenti studi hanno utilizzato sistemi PAFC per il rilevamento delle cellule utilizzando contrasto endogeno ed esogeno14,15. Gli agenti di contrasto ad assorbimento della luce vicino all’infrarosso (NIR) come il colorante verde indocianina e gli NP metallici (ad esempio oro e CuS) sono stati utilizzati per l’etichettatura selettiva di cellule e tessuti in combinazione con l’imaging fotoacustico16,17,18. A causa della migliore profondità di penetrazione della luce NIR all’interno dei tessuti biologici, il rilevamento fotoacustico degli assorbitori può essere eseguito a maggiori profondità per le applicazioni cliniche. A causa del suo grande potenziale di utilizzo nella clinica, la combinazione di agenti di contrasto NIR mirati con PAFC ha generato un notevole interesse per il rilevamento dei CTC.
IL PAFC in combinazione con agenti a contrasto mirati fornisce un approccio migliorato per l’analisi ad alta velocità dei campioni dei pazienti con maggiore precisione e rilevamento mirato dei CTC. Una delle principali strategie di rilevamento per i CTC è il targeting specifico delle proteine della membrana presenti sulla cellula di interesse. Una caratteristica notevole dei CTC ovarici è la sovraespressione dei recettori del folato situati sulla loro membrana esterna19. Il targeting del recettore del folato è una strategia ideale per l’identificazione dei CTC ovarici nel sangue perché le cellule endogene, che hanno una maggiore espressione dei recettori degli acidi folichi, sono generalmente luminose e hanno un’esposizione limitata al flusso sanguigno20. Gli NP di solfuro di rame (CUS NP) sono stati recentemente riconosciuti per la loro capacità di indirizzare i recettori del folato espressi sulle cellule cancerose21. In combinazione con la loro biocompatibilità, facilità di sintesi e assorbimento in profondità nella NIR, questi agenti di contrasto NP fanno una strategia di targeting ideale per il rilevamento di TIC ovarici che utilizzano il PAFC.
Questo lavoro descrive la preparazione degli NP FA-CuS e il loro utilizzo per il rilevamento delle cellule tumorali ovariche in un sistema di flusso fotoacustico. Gli NP CuS sono modificati con acido folico per indirizzare specificamente CTC ovarici ed emettono un segnale fotoacustico quando stimolati con un laser da 1.053 nm. I risultati indicano il successo del rilevamento di cellule tumorali ovariche incubate con questi agenti di contrasto fotoacustico all’interno del sistema PAFC. Questi risultati mostrano il rilevamento delle cellule tumorali ovariche fino a concentrazioni di 1 cellula/L, e la microscopia a fluorescenza conferma l’assorbimento di successo di queste particelle da parte delle cellule tumorali ovariche SKOV-322. Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata della sintesi degli NP FA-CuS, la preparazione di campioni per la microscopia a fluorescenza, la costruzione del sistema a flusso fotoacustico e il rilevamento fotoacustico delle cellule tumorali ovariche. Il metodo presentato mostra una corretta identificazione dei CTC ovarici nel flusso che utilizzano gli NP FA-CuS. Il lavoro futuro si concentrerà sull’applicazione clinica di questa tecnologia verso la diagnosi precoce delle metastasi del cancro ovarico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è un metodo semplice per il rilevamento di TIC ovarici che utilizzano PAFC e un agente di contrasto CuS mirato. Sono stati esplorati molti metodi per il rilevamento di CTC ovarici, tra cui dispositivi microfluidici, RT-PCR e citometria del flusso di fluorescenza23,24,25. Questi variano in complessità, costi e precisione, limitando la loro efficacia in ambienti clinici. PAFC introduce diversi vantaggi rispetto…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere Madeleine Howell per il suo aiuto con la sintesi, Matthew Chest per il suo aiuto nella progettazione del sistema di flusso e Ethan Marschall per l’assistenza con SolidWorks.
Materials
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1X) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution .4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
Referencias
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