Um protocolo é apresentado para detectar células tumorais ovarianas circulantes utilizando um sistema de fluxo fotoacústico feito medida e nanopartículas de sulfeto de cobre cobertas de ácido fólico.
Muitos estudos sugerem que a enumeração das células tumorais circulantes (CTCs) pode mostrar a promessa como uma ferramenta prognóstico para o câncer de ovário. As estratégias atuais para a detecção de CTCs incluem citometria de fluxo, dispositivos microfluídicos e reação em cadeia de polimerase em tempo real (RT-PCR). Apesar dos avanços recentes, os métodos para a detecção da metástase precoce do câncer de ovário ainda não têm a sensibilidade e especificidade necessárias para a tradução clínica. Aqui, um novo método é apresentado para a detecção de células tumorais circulantes ovarianas por citometria de fluxo fotoacústico (PAFC) utilizando um sistema impresso tridimensional personalizado (3D), incluindo uma câmara de fluxo e uma bomba de seringa. Este método utiliza nanopartículas de sulfeto de cobre tampados com ácido fólico (FA-CuS NPs) para atingir células cancerosas ovarianas SKOV-3 pela PAFC. Este trabalho demonstra a afinidade destes agentes de contraste para pilhas ovarianas do cancro. Os resultados mostram caracterização de PN, detecção de PAFC e captação de NP por microscopia de fluorescência, demonstrando assim o potencial deste novo sistema para detectar CTCs ovarianos em concentrações fisiologicamente relevantes.
O câncer de ovário é uma das neoplasias ginecológicas mais mortais e resultou em cerca de 184.800 mortes em todo o mundo em 20181. Vários estudos têm mostrado a correlação entre a progressão do câncer de ovário (ou seja, metástase) e a presença de CTCs2,3,4. O método mais comum para detecção e isolamento de CTCs utiliza o sistema Cellsearch, que tem como alvo o receptor EpCam5. Expressão EpCam, no entanto, é downregulated em epitelial para transição mesenchymal, que tem sido implicado na metástase do câncer6. Apesar dos avanços, as tecnologias clínicas atuais ainda sofrem de baixa precisão, alto custo e complexidade. Devido a essas desvantagens, novas tecnologias para a descoberta e enumeração de CTCs ovarianos tornou-se uma área importante para a pesquisa.
Recentemente, a PAFC surgiu como um método eficaz para a detecção não invasiva de células cancerosas, análise de nanomateriais e identificação de bactérias7,8,9. PAFC difere da citometria do fluxo de fluorescência tradicional, detectando anallítos no fluxo, utilizando fotoacústica. O efeito fotoacústico é gerado quando a luz laser é absorvida por um material que causa expansão termoelástica, produzindo uma onda acústica que pode ser detectada por um transdutor de ultrassom10,11. As vantagens da PAFC em relação aos métodos tradicionais de citometria de fluxo incluem simplicidade, facilidade de tradução para ambientes clínicos e a detecção de CTCs em profundidades sem precedentes nas amostras de pacientes12,13. Estudos recentes têm utilizado sistemas de PAFC para a detecção de células usando contraste endógeno e exógeno14,15. Agentes de contraste de absorção de luz próximos ao infravermelho (NIR), como corante verde de indocianina, e NPs metálicos (por exemplo, ouro e CuS) têm sido usados para a rotulagem seletiva de células e tecidos em combinação com imagens fotoacústicas16,17,18. Devido à profundidade melhorada da penetração da luz nir dentro dos tecidos biológicos, a detecção fotoacústica de absorventes pode ser realizada em maiores profundidades para aplicações clínicas. Devido ao seu grande potencial de utilização na clínica, a combinação de agentes de contraste nir alvo com PAFC tem gerado um interesse considerável para a detecção de CTCs.
A PAFC em combinação com agentes de contraste direcionados fornece uma abordagem melhorada para análise de alta taxa de taxa de taxa de avaliação de amostras de pacientes com maior precisão e detecção direcionada de CTCs. Uma das principais estratégias de detecção para CTCs é a segmentação específica das proteínas de membrana presentes na célula de interesse. Uma característica notável dos CTCs ovarianos é a superexpressão dos receptores de folato localizados em sua membrana externa19. A segmentação do receptor de folato é uma estratégia ideal para a identificação de CTCs ovarianos no sangue porque as células endógenas, que têm maior expressão de receptores de ácido fólico, são geralmente luminais e têm exposição limitada à corrente sanguínea20. NPs sulfeto de cobre (CuS NPs) foram recentemente reconhecidos por sua capacidade de atingir receptores de folato expressos em células cancerosas21. Combinados com sua biocompatibilidade, facilidade de síntese e absorção profunda no NIR, esses agentes de contraste np fazem uma estratégia de segmentação ideal para a detecção de CTCs ovarianos utilizando PAFC.
Este trabalho descreve a preparação de FA-CuS NPs e seu uso para a detecção de células cancerosas ovarianas em um sistema de fluxo fotoacústico. Os PNNs CuS são modificados com ácido fólico para atingir especificamente CTCs ovarianos e emitem um sinal fotoacústico quando estimulados com um laser de 1.053 nm. Os resultados indicam a detecção bem sucedida de células cancerosas ovarianas incubadas com esses agentes de contraste fotoacústico dentro do sistema PAFC. Estes resultados mostram a detecção de células cancerosas ovarianas até concentrações de 1 célula/μL, e microscopia fluorescência confirma a captação bem sucedida dessas partículas por células cancerosas ovarianas SKOV-322. Este trabalho fornece uma descrição detalhada da síntese fa-cus nps, preparação de amostras para microscopia de fluorescência, construção do sistema de fluxo fotoacústico, e a detecção fotoacústica de células cancerosas ovarianas. O método apresentado mostra a identificação bem sucedida de CTCs ovarianos no fluxo que utiliza FA-CuS NPs. O trabalho futuro centrar-se-á sobre a aplicação clínica desta tecnologia para a deteção adiantada da metástase ovariana do cancro.
Este protocolo é um método direto para a detecção de CTCs ovarianos utilizando PAFC e um agente de contraste CuS alvo. Muitos métodos têm sido explorados para a detecção de CTCs ovarianos, incluindo dispositivos microfluídicos, RT-PCR e citometria fluorescênciafluxo 23,24,25. Estes variam em complexidade, custo e precisão, limitando sua eficácia em ambientes clínicos. A PAFC introduz várias vantagens sobre esses m?…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de reconhecer Madeleine Howell por sua ajuda com a síntese, Matthew Chest por sua ajuda para projetar o sistema de fluxo, e Ethan Marschall para assistência com SolidWorks.
0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
0.2 µm 1000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
3D Printed Tank | Custom-made | ||
Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
RPMI Midum 1640 (1X) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
Trypan Blue Solution .4% | Amresco | K940-100ML | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |