Detecção de câncer de ovário usando citometria de fluxo fotoacústico

Summary

Um protocolo é apresentado para detectar células tumorais ovarianas circulantes utilizando um sistema de fluxo fotoacústico feito medida e nanopartículas de sulfeto de cobre cobertas de ácido fólico.

Abstract

Muitos estudos sugerem que a enumeração das células tumorais circulantes (CTCs) pode mostrar a promessa como uma ferramenta prognóstico para o câncer de ovário. As estratégias atuais para a detecção de CTCs incluem citometria de fluxo, dispositivos microfluídicos e reação em cadeia de polimerase em tempo real (RT-PCR). Apesar dos avanços recentes, os métodos para a detecção da metástase precoce do câncer de ovário ainda não têm a sensibilidade e especificidade necessárias para a tradução clínica. Aqui, um novo método é apresentado para a detecção de células tumorais circulantes ovarianas por citometria de fluxo fotoacústico (PAFC) utilizando um sistema impresso tridimensional personalizado (3D), incluindo uma câmara de fluxo e uma bomba de seringa. Este método utiliza nanopartículas de sulfeto de cobre tampados com ácido fólico (FA-CuS NPs) para atingir células cancerosas ovarianas SKOV-3 pela PAFC. Este trabalho demonstra a afinidade destes agentes de contraste para pilhas ovarianas do cancro. Os resultados mostram caracterização de PN, detecção de PAFC e captação de NP por microscopia de fluorescência, demonstrando assim o potencial deste novo sistema para detectar CTCs ovarianos em concentrações fisiologicamente relevantes.

Introduction

O câncer de ovário é uma das neoplasias ginecológicas mais mortais e resultou em cerca de 184.800 mortes em todo o mundo em 2018¹. Vários estudos têm mostrado a correlação entre a progressão do câncer de ovário (ou seja, metástase) e a presença de CTCs^2,3,4. O método mais comum para detecção e isolamento de CTCs utiliza o sistema Cellsearch, que tem como alvo o receptor EpCam^5. Expressão EpCam, no entanto, é downregulated em epitelial para transição mesenchymal, que tem sido implicado na metástase do câncer⁶. Apesar dos avanços, as tecnologias clínicas atuais ainda sofrem de baixa precisão, alto custo e complexidade. Devido a essas desvantagens, novas tecnologias para a descoberta e enumeração de CTCs ovarianos tornou-se uma área importante para a pesquisa.

Recentemente, a PAFC surgiu como um método eficaz para a detecção não invasiva de células cancerosas, análise de nanomateriais e identificação de bactérias^7,8,9. PAFC difere da citometria do fluxo de fluorescência tradicional, detectando anallítos no fluxo, utilizando fotoacústica. O efeito fotoacústico é gerado quando a luz laser é absorvida por um material que causa expansão termoelástica, produzindo uma onda acústica que pode ser detectada por um transdutor de ultrassom^10,11. As vantagens da PAFC em relação aos métodos tradicionais de citometria de fluxo incluem simplicidade, facilidade de tradução para ambientes clínicos e a detecção de CTCs em profundidades sem precedentes nas amostras de pacientes^12,13. Estudos recentes têm utilizado sistemas de PAFC para a detecção de células usando contraste endógeno e exógeno^14,15. Agentes de contraste de absorção de luz próximos ao infravermelho (NIR), como corante verde de indocianina, e NPs metálicos (por exemplo, ouro e CuS) têm sido usados para a rotulagem seletiva de células e tecidos em combinação com imagens fotoacústicas^16,17,18. Devido à profundidade melhorada da penetração da luz nir dentro dos tecidos biológicos, a detecção fotoacústica de absorventes pode ser realizada em maiores profundidades para aplicações clínicas. Devido ao seu grande potencial de utilização na clínica, a combinação de agentes de contraste nir alvo com PAFC tem gerado um interesse considerável para a detecção de CTCs.

A PAFC em combinação com agentes de contraste direcionados fornece uma abordagem melhorada para análise de alta taxa de taxa de taxa de avaliação de amostras de pacientes com maior precisão e detecção direcionada de CTCs. Uma das principais estratégias de detecção para CTCs é a segmentação específica das proteínas de membrana presentes na célula de interesse. Uma característica notável dos CTCs ovarianos é a superexpressão dos receptores de folato localizados em sua membrana externa¹⁹. A segmentação do receptor de folato é uma estratégia ideal para a identificação de CTCs ovarianos no sangue porque as células endógenas, que têm maior expressão de receptores de ácido fólico, são geralmente luminais e têm exposição limitada à corrente sanguínea²⁰. NPs sulfeto de cobre (CuS NPs) foram recentemente reconhecidos por sua capacidade de atingir receptores de folato expressos em células cancerosas²¹. Combinados com sua biocompatibilidade, facilidade de síntese e absorção profunda no NIR, esses agentes de contraste np fazem uma estratégia de segmentação ideal para a detecção de CTCs ovarianos utilizando PAFC.

Este trabalho descreve a preparação de FA-CuS NPs e seu uso para a detecção de células cancerosas ovarianas em um sistema de fluxo fotoacústico. Os PNNs CuS são modificados com ácido fólico para atingir especificamente CTCs ovarianos e emitem um sinal fotoacústico quando estimulados com um laser de 1.053 nm. Os resultados indicam a detecção bem sucedida de células cancerosas ovarianas incubadas com esses agentes de contraste fotoacústico dentro do sistema PAFC. Estes resultados mostram a detecção de células cancerosas ovarianas até concentrações de 1 célula/μL, e microscopia fluorescência confirma a captação bem sucedida dessas partículas por células cancerosas ovarianas SKOV-3²². Este trabalho fornece uma descrição detalhada da síntese fa-cus nps, preparação de amostras para microscopia de fluorescência, construção do sistema de fluxo fotoacústico, e a detecção fotoacústica de células cancerosas ovarianas. O método apresentado mostra a identificação bem sucedida de CTCs ovarianos no fluxo que utiliza FA-CuS NPs. O trabalho futuro centrar-se-á sobre a aplicação clínica desta tecnologia para a deteção adiantada da metástase ovariana do cancro.

Protocol

1. Síntese e Funcionalização de Nanopartículas NOTA: Síntese do FA-CuS NPs é alcançado usando um método de síntese de um pote adaptado de um protocolo publicado anteriormente21.CUIDADO: Toda a síntese deve ocorrer em uma capa química ventilada da emuman. Antes da síntese, filtre aproximadamente 300 mL de água desionizada (DI) através de um filtro estéril de 0,2 μm. Limpe um frasco de fundo redondo de vidro de 250 mL com uma soluç…

Representative Results

A Figura 1A mostra uma imagem TÍPICA DE TEM das nanopartículas sintetizadas. O tamanho médio da nanopartícula típica é de aproximadamente 8,6 nm ± 2,5 nm. A medição de nanopartículas foi realizada no ImageJ. As funções do ponto inicial e da bacia hidrográfica foram aplicadas para separar as partículas para medição. Os diâmetros horizontais e verticais de cada partícula foram medidos perpendiculares uns aos outros e mais em m…

Discussion

Este protocolo é um método direto para a detecção de CTCs ovarianos utilizando PAFC e um agente de contraste CuS alvo. Muitos métodos têm sido explorados para a detecção de CTCs ovarianos, incluindo dispositivos microfluídicos, RT-PCR e citometria fluorescência^{fluxo 23,24,25}. Estes variam em complexidade, custo e precisão, limitando sua eficácia em ambientes clínicos. A PAFC introduz várias vantagens sobre esses m?…

Materials

0.025% Trypsin With EDTA	Corning	25-053-Cl
0.2 µm 1000 mL Vacuum Filtration Unit	VWR	10040-440	For filtering larger volumes of DI water.
0.2 µm sterile syringe filter	VWR	28145-477
3D Printed Tank		Custom-made
Acquisition Card	National Instruments	PXIe-5170R	250 MS/s, 8-Channel, 14-bit
Alconox	Sigma-Aldrich	242985-1.8KG	Detergent used for cleaning glassware.
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters	Millipore	UFC903024
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters	Millipore	UFC803024
Bright-Line Hematocytometer	Hausser Scientific	1492
Copper(II) Chloride	ACROS ORGANICS	206532500
Coupling Objective	Thorlabs	LMH-10x-532	To couple pulsed light to optical fiber.
Coupling Stage	Newport	F-91-C1-T	Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532
CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath	Fisherbrand	Model CPX3800
Data Acquisition software	National Instruments	NI LabVIEW 2017 (32-bit)	LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition.
Data Processing Software	Mathworks	Matlab R2016a	Reconstructions and graphs produced using Matlab software.
FBS	Sigma-Aldrich	F2442-500ML
Fiber Chuck	Newport	FPH-DJ	Used to hold the bare fiber.
Fiber Coupler	Newport	FP-1A	3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective.
Folic Acid	Sigma-Aldrich	F7876-10G
Formvar Coated TEM Grids	Electron Microscopy Sciences	FCF300-CU-SB
Masterflex Tubing	Cole Parmer	EW-96420-14
McCoy's 5A Medium	ATCC	30-2007
Norm-Ject 10 mL Syringes	HENKE SASS WOLF	4100-X00V0
Optical Fiber	Thorlabs	FG550LEC	Used to expose sample to pulsed light.
PBS	Alfa Aesar	J62036
Penicillin Streptomycin	GIBCO	15140-122
Pulsed Laser	RPMC Lasers Inc	Quantus-Q1D-1053	Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum.
Pulser/Receiver	Olympus	5077PR	Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain.
Quartz Capillary Tube	Sutter Instrument	QF150-75-10
RPMI Midum 1640 (1X) Folic Acid Free	Gibco	27016-021
Silicone	Momentive Performance Materials, Inc.	GE284
SKOV-3 Cells	ATCC	HTB-77
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	S7795-500G
Sodium Hydroxide Beads	BDH	BDH9292-500G
Sodium Sulfide Nonahydrate	Sigma-Aldrich	431648-50G
Syringe Pumps	New Era Pump Systems Inc	DUAL-1000
Texas Red-X-Succinimydl ester	Invitrogen	1949071
Transducer	Olynmpus	V214-BB-RM	Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%.
Trypan Blue Solution .4%	Amresco	K940-100ML
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML
Ultrasound Gel	Parker Laboratories Inc.	Aquasonic 100	Ultrasound gel for transducer coupling