Dit protocol beschrijft een methode om individuele hersenverouderingstrajecten te volgen via een hersendonatieprogramma en de juiste karakterisering van hersenen. Hersendonoren zijn betrokken bij een langdurige longitudinale studie met inbegrip van seriële multi-dimensionale beoordelingen. Het protocol bevat een gedetailleerde beschrijving van de verwerking van de hersenen en een nauwkeurige diagnostische methodologie.
In een voortdurend vergrijzende bevolking, de prevalentie van neurodegeneratieve aandoeningen zal naar verwachting stijgen. Inzicht in ziektemechanismen is de sleutel tot het vinden van preventieve en curatieve maatregelen. De meest effectieve manier om dit te bereiken is door middel van direct onderzoek van ziek en gezond hersenweefsel. De auteurs presenteren een protocol te verkrijgen, verwerken, karakteriseren en opslaan van goede kwaliteit hersenweefsel geschonken door individuen geregistreerd in een antemortem hersenen donatie programma. Het donatieprogramma omvat een persoonlijke empathische benadering van mensen, een verzameling aanvullende klinische, biologische, sociale en lifestyle-informatie en seriële multidimensionale beoordelingen in de loop van de tijd om individuele trajecten van normale veroudering en cognitieve achteruitgang te volgen. Omdat veel neurologische ziekten asymmetrisch zijn, biedt onze hersenbank een uniek protocol voor het snijden van verse exemplaren. Hersensecties van beide hemisferen worden afwisselend bevroren (bij -80 °C) of vastgezet in formaline; een vast plak op één hemisfeer beantwoordt aan bevroren op de andere hemisfeer. Met deze benadering kan een volledige histologische karakterisering van alle bevroren materiaal worden verkregen, en omics studies kunnen worden uitgevoerd op histologisch goed gedefinieerde weefsels van beide hemisferen waardoor een meer volledige beoordeling van neurodegeneratieve ziektemechanismen. Een correcte en definitieve diagnose van deze ziekten kan alleen worden bereikt door het klinische syndroom te combineren met de neuropathologische evaluatie, die vaak belangrijke etiologische aanwijzingen toevoegt die nodig zijn om de pathogenese te interpreteren. Deze methode kan tijdrovend, duur en beperkt zijn, omdat deze slechts een beperkt geografisch gebied bestrijkt. Ongeacht de beperkingen, de hoge mate van karakterisering biedt kan de moeite waard zijn. Ons uiteindelijke doel is om de eerste Italiaanse Hersenbank op te richten, terwijl de nadruk ligt op het belang van neuropathologisch geverifieerde epidemiologische studies.
Volgens de WHO lijden momenteel ongeveer 50 miljoen mensen aan dementie, een cijfer dat tegen 2050 naar verwachting zal verdrievoudigen. De ziekte van Alzheimer is de belangrijkste oorzaak van dementie, gevolgd door cerebrovasculaire ziekte en andere leeftijdsgebonden neurodegeneratieve aandoeningen. In 2017 ontwikkelde de WHO het Global Dementia Observatory om het bewustzijn van dementie te vergroten en een wereldwijd actieplan tegen het te stimuleren1. Elk individu heeft zijn eigen hersenverouderingstraject, daarom kan het zoeken naar de genezing uitdagend zijn vanwege de complexiteit van de pathogenese van neurodegeneratieve ziekten. Misschien bezit elke persoon zijn of zijn eigen pathogenese geschreven in het hersenweefsel die een gepersonaliseerde aanpak vereist. Zo zal de studie van hersenweefsel de sleutel zijn tot het begrijpen van de mechanismen van neurodegeneratie.
Terugkijkend op de geschiedenis van de neurowetenschappen, realiseren we ons dat de meest indrukwekkende en baanbrekende ontdekkingen nooit hadden kunnen plaatsvinden zonder het directe onderzoek van het menselijk brein. Door de tijd heen is de bron van hersenweefsel veranderd van ruwe dissecties, willekeurige ‘toevallige ontmoetingen’ en, in sommige gevallen, illegale handel, naar georganiseerde hersencollecties en strategische moderne hersenbanken. De overweging van vele ethische aspecten is een van de belangrijkste factoren die moderne hersenbanken onderscheiden van de hersenverzamelingen uit het verleden. De eerste echte moderne Brain Banks (BB’s) werden ingesteldth in de tweede helft van de 20e eeuw. Nicholas Corsellis en Wallace Tourtelotte kunnen worden beschouwd als pioniers van de moderne hersenen bankieren. In het Verenigd Koninkrijk, Corsellis geassembleerd een collectie bedrijf meer dan 1000 goed gedocumenteerde hersenen getroffen met verschillende psychische en neurologische aandoeningen2. Bovendien heeft Corsellis geholpen de noodzaak aan het licht te brengen om vers hersenweefsel in ijs te bewaren omwille van biochemische tests3. Ondertussen in de VS, Wallace Tourtelotte introduceerde antemortem hersenen donatie programma’s om het werven van potentiële hersendonoren te vergemakkelijken en ervoor te zorgen dat de verzamelde hersenen vergezeld gaan van een volledige medische en neurologische geschiedenis4,5. Voor een historisch overzicht van hersencollecties en moderne BB’s, zie Carlos et al. 6.
Waarom hebben we nog steeds menselijke hersenen nodig? Hersenziekten kunnen alleen een definitieve diagnose krijgen na neuropathologisch onderzoek. Neuropathologie daagt de klinische diagnose uit en is de sleutel tot een correcte interpretatie van de klinische symptomen en de ontdekking van de histologische grondslagen van nieuwe syndromische varianten. De diagnose kan namelijk opnieuw worden gedefinieerd op basis van het pathologische beeld. Niettemin, de autopsie tarief is gedaald in de laatste decennia als gevolg van de recente ontwikkeling van innovatieve neuroimaging technieken. Door middel van beeldvorming in de hersenen kunnen de morfologische, functionele en metabole veranderingen in de hersenen, evenals de omvang van eiwitmismappen, in vivoworden beoordeeld. Echter, in vivo neuroimaging en andere biomarker studies kan alleen een “schatting” van het pathologische beeld te geven als ze niet in staat zijn om subtiele cellulaire en moleculaire veranderingen te detecteren. De vooruitgang in moleculaire beeldvorming en de ontdekking van nieuwe biomarkers, doelmoleculen, en tracers7 (b.v., amyloïde, TAU, microglial tracers) maken het menselijke hersenen nog onontbeerlijker aan de interpretatie van gegevens die uit klinische evaluaties en biomarker testen worden verkregen. Bovendien zijn de omics-technologieën (genomics, epigenomics, transcriptomics, metabolomics, proteomics, lipidomics, enz.), uitgevoerd op vers en bevroren hersenweefsel, opende nieuwe mogelijkheden voor het begrijpen van ziektemechanismen en het ontdekken van risicogenen, nieuwe diagnostische en prognostische markers, en potentiële medicijndoelen8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 , 2121,22,23.,,
Voor deze doeleinden archiveren moderne BB’s goed gekarakteriseerde, hoogwaardige hersenweefsels die ze beschikbaar maken voor de wetenschappelijke gemeenschap3,24. De hersenen die door BB’s worden geleverd, moeten gepaard gaan met een volledige klinische geschiedenis. De activiteit van een BB omvat het volgende: (1) Erkenning en rekrutering van zieke en gezonde individuen aan hersendonatieprogramma’s; de ideale voorwaarde zou zijn om gedurende het hele leven een multidisciplinaire follow-up van donoren te bereiken om een volledige klinische, levensstijl en sociale geschiedenis en biomarkerprofielen te verkrijgen; inderdaad, cognitieve reserve en hersenstructuur zijn afhankelijk van levensstijl en sociaal-educatieve factoren25,26, dus deze informatie verrijkt de totale gegevens bij de hand. (2) Verwerving van de hersenen (bestaande uit cerebrum, cerebellum en hersenstam) en aanverwante weefsels (bijvoorbeeld ruggenmerg, schedelzenuwen en ganglia, enz.) na de ondergang van de donor, terwijl de gestandaardiseerde wettelijke en ethische voorschriften in acht worden nemen. (3) Passende verwerking (dissectie, fixatie, bevriezing) van de hersenen, zoals gedefinieerd in een gestandaardiseerd operatief protocol, om weefsel van hoge kwaliteit te verkrijgen en om toekomstig gebruik in multidisciplinair onderzoek mogelijk te maken. (4) Gedetailleerde neuropathologische karakterisering die een definitieve definitieve diagnose geeft. (5) Opslag en distributie van weefselmateriaal aan onderzoeksgemeenschap27,28.
Alle BB’s slaan zowel bevroren als formaline-vaste-paraffine ingebedde weefsels op. Elke BB heeft zijn eigen protocol. Behalve voor bepaalde studies, zoals het bihemispheric snijden protocol van het Biomedical Research Institute (New Jersey)29 en de Deramecourt’s studie van cerebrovasculaire pathologie30, de grootste BB’s in de wereld gewoon snijd de cerebrum, cerebellum en hersenstam langs de middellijn (sagitttal vlak). De ene helft wordt vers ontleed en vervolgens ingevroren voor biochemische studies, terwijl de andere in formaline wordt vastgesteld voor histopathologische beoordeling. Biochemische en histopathologische analyses worden dus afzonderlijk uitgevoerd op elk halfrond. De beslissing over welke zijde vast of bevroren is (lateraliteit), hangt af van de bijzondere bank31,32,33,34,35. Omdat veel neurologische ziekten asymmetrisch zijn, biedt onze BB een uniek protocol voor het snijden van verse hersenen: aangrenzende delen van de hersenstam en elk halfrond worden afwisselend vast en bevroren; een vast plak op één hemisfeer beantwoordt aan bevroren op de andere hemisfeer. Door middel van deze methode wordt het gebruik van hersenweefsel geoptimaliseerd en kan een volledige histologische karakterisering van al bevroren materiaal worden bereikt met de mogelijkheid om histologische en biochemische informatie uit alle gebieden van beide halfronden te verkrijgen en te vergelijken.
Het frame van ons hersenbank project is de stad Abbiategrasso. Abbiategrasso is een kleine stad ongeveer 22 km ten zuidwesten van de stad Milaan, in Noord-Italië. Het heeft een bevolking van ongeveer 32.600 mensen. Het is de thuisbasis van de Golgi-Cenci (GC) Foundation. GC Foundation maakt deel uit van een groot Revalidatie Geriatrisch Ziekenhuis (ASP Golgi-Redaelli), en is een instituut gericht op onderzoek naar veroudering en ouderenzorg. In het bijzonder richt het zich op het bestuderen van mentale veroudering, de sociale en gedragsfactoren die het beïnvloeden, en de biologie en pathologie die ten grondslag liggen aan leeftijdsafhankelijke neurocognitieve aandoeningen (NCD’s). In 2009 lanceerde de GC Foundation een nieuwe longitudinale studie met 1321 deelnemers (van de 1644 in aanmerking komende proefpersonen: initiële respons van 80,3%) geboren tussen 1935 en 1939 (tussen 70-75 jaar), van Kaukasische etniciteit, die in het zelfde kleine geografische gebied leeft. De studie heette InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; in het Engels: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) en is momenteel aan de gang. InveCe.Ab is gepland om een cohort met maximale homogeniteit en minste variabiliteit te verkrijgen om de incidentie, prevalentie en natuurlijke geschiedenis van dementie te beoordelen, samen met de mogelijke risico’s of beschermende factoren, waaronder gedrags-, psychosociale, klinische en biologische variabelen36. De kenmerken van het cohort zijn opgenomen in figuur 1 es tabel 1. De epidemiologische gegevens komen overeen met de dementietrend bij de Europese bevolking37,,38 en InveCe.Ab-deelnemers hebben homogene genetische en milieukenmerken, die een goed model vertegenwoordigen om het traject te bestuderen van normale veroudering tot neurocognitieve aandoeningen. Homogene populaties vereisen immers minder proefpersonen om voldoende statistische macht te bereiken. De InveCe.Ab-methode is al elders gemeld36, maar het is belangrijk om de multidimensionale aanpak te onderstrepen door middel van periodieke controles (om de 2-3 jaar) met behulp van dezelfde set evaluaties, waaronder: bloedbemonstering (metabole paneel, homocysteïne en vitaminen, DNA-extractie om Apolipoprotein E (APOE) en andere genetische polymorfismen gerelateerd aan cognitie en veroudering te profileren), antropometrische metingen (gewicht, lengte en taille), Talking While Walking Test (dubbele taaktest), een interview om levensstijl te beoordelen (mediterrane dieettrouw, niveaus van fysieke activiteit en cognitieve betrokkenheid) en sociale factoren (sociale betrokkenheid, eenzaamheid), een neuropsychologische evaluatie en een klinisch algemeen onderzoek. Het vergelijken van dergelijke longitudinale gegevens met postmortem neuropathologische gegevens zou cruciaal zijn voor onderzoek. Daarom heeft ons team en in het bijzonder Dr. Michela Mangieri de hierboven genoemde neuropathologische benadering bedacht. Sinds 2014 en tijdens de tweede follow-up werden de InveCe.Ab deelnemers gevraagd om hun hersenen te doneren, en zo de geboorte van de Abbiategrasso Brain Bank (ABB)tot stand te brengen. De belangrijkste donoren van ABB zijn de InveCe.Ab deelnemers, maar ABB staat nu open voor andere vrijwillige donateurs. Het zijn patiënten van ASP Golgi-Redaelli, de thuisbasis van verschillende patiënten die getroffen zijn door verschillende neurologische aandoeningen of volwassen vrijwilligers die meer te weten komen over het ABB-project en tot hetzelfde geografische gebied behoren (Abbiategrasso en omgeving). Alle donoren ondergaan hetzelfde evaluatieprotocol.
De auteurs stellen een methode voor om individuele trajecten van normale veroudering en de mogelijke progressie naar NCD’s te volgen en om hersenen die van dergelijke donoren zijn verkregen, in de lengterichting nauwkeurig te beheren, te verwerken en te karakteriseren. Bovendien is het ons doel om individuen te ontmoeten en te betrekken bij periodieke neurologische beoordelingen, seminars en educatieve activiteiten met betrekking tot het welzijn van de hersenen en om hun bewustzijn van hersendonatie voor onderzoeksdoeleinden te vergroten.
Kritieke stappen in het protocol
Ons doel is om weefsels van goede kwaliteit te verkrijgen, te karakteriseren en op te slaan afkomstig van proefpersonen met een gedetailleerde geschiedenis die is afgeleid van longitudinale observatie. Om dit doel te bereiken, is het nodig om de volgende belangrijke aspecten te behandelen. Zoals hierboven beschreven, begint het protocol met de aanwerving van donoren, wat de eerste cruciale stap is. Vervolgens is het noodzakelijk dat de donoren het follow-upprogramma voortzetten en de hechting aan het project na verloop van tijd behouden tot de werkelijke donatie van de hersenen. Op het moment van overlijden is het noodzakelijk dat het ABB-personeel onmiddellijk op de hoogte wordt gebracht om het autopsieteam binnen 24 uur bijeen te roepen, wat belangrijk is voor een adequate weefselkwaliteit. Vers snijden van de hersenhelften vereist een vaste hand en een specifieke training. Om te voorkomen dat cellulaire schade veroorzaakt door langzame bevriezing en het verkrijgen van een goede kwaliteit plakjes voor de cryostat en Omics, is het belangrijk dat ze snel worden bevroren. Gezien de snelheid van penetratie van formaline oplossing (1 mm /uur), om weefsel antigeniciteit te behouden de weken tijd van de enkele plak wordt gehouden op zijn minimum.
Probleemoplossing van de methode
Om de hierboven genoemde kritische stappen aan te pakken bieden wij de volgende aanpak. Donor werving en naleving van follow-ups: Er zijn verschillende factoren die hersendonatie belemmeren, waaronder angst voor het beschadigen van het lichaam figuur, zuiverheid en integriteit, of van de mogelijkheid van het voelen van pijn na de dood. Sommigen maken zich zelfs zorgen dat de autopsie kan worden uitgevoerd terwijl ze nog in leven zijn70,71. Bezorgdheid over verstoring van de uitvaartregelingen en de financiële lasten zijn ook aanwezig72. Bovendien kan het gebrek aan kennis van een medisch personeel over postmortemprocedures en het onvermogen om de zorgen van potentiële donoren of hun NOK aan te pakken, de registratie ontmoedigen. Al deze factoren kunnen leiden tot een laag niveau van bewustzijn met een laag aantal ingeschreven deelnemers en een hoge kans op donorverlies na verloop van tijd. Het wervingsprogramma voor donoren moet immers efficiënt zijn in het verspreiden van bewustzijn, het wekken van vertrouwen en het overtuigen van mensen om zich te registreren en hoge percentages follow-up participatie te handhaven. In onze ervaring wordt dit gedaan door zorgvuldige selectie van potentiële donoren en een grondige uitleg van de doelstellingen van de BB. Wij bieden educatieve activiteiten en een empathische aanpak gericht op de angsten en behoeften van zowel gezonde mensen als mensen die getroffen zijn met neurodegeneratieve ziekten en hun families. We merken dat potentiële donoren meer kans hebben om hun toestemming te geven wanneer ze persoonlijk worden benaderd. Een face-to-face benadering creëert een relatie gebaseerd op wederzijds vertrouwen en respect die van fundamenteel belang is voor het bereiken van een hoog percentage van de registratie van hersendonatie en follow-up beoordelingen. Een hoog opgeleid personeel met een sterk gevoel voor ethiek benadert eerst de potentiële donor, bespreekt de mogelijkheid om de hersenen te doneren na de dood, verklaart de waarde van menselijk hersenweefsel aan neurowetenschappelijk onderzoek en verduidelijkt elke twijfel met betrekking tot postmortemprocedures. Gunstige mond-tot-mondreclame is even belangrijk. Na het oogsten van de hersenen wordt de nodige aandacht en zorg gegeven om het kadaver opnieuw samen te stellen. Het is belangrijk om respect en dankbaarheid te tonen aan de overledene door de behandeling van het kadaver zachtjes. Een paar maanden later is een vergadering gepland om de resultaten van de neuropathologische analyse te communiceren wanneer gevraagd door familieleden.
Het tijdstip van overlijden en hersenoogst: Wanneer de persoon accepteert, worden ze donor en krijgen ze een identiteitskaart met een nummer om 24 uur per dag, 7 dagen/week contact op te nemen (het ontvangstnummer van het ASP Golgi-Redaelli Geriatrie Ziekenhuis dat met ons verbonden is). Bovendien wordt een kleeflabel gegeven aan de familieleden die in geval van ziekenhuisopname moeten worden gebruikt. De uitvaartorganisaties van het gebied werden eerder geïnformeerd om het lichaam naar de ABB-faciliteiten te brengen, waar het autopsieteam wordt opgeroepen. Het autopsieteam bestaat uit een patholoog, een neuroloog en/of een neurobioloog en een anatomisch ruimtetechnicus, die dagelijks van 6.00 tot 23.00 uur op afroep zijn; sommige studenten in opleiding zijn ook vaak aanwezig om te helpen en foto’s te maken.
De precisie en consistentie van de verse snijprocedures worden gewaarborgd door de betrokkenheid van dezelfde twee operatoren (een neuroloog en een patholoog) die de methode hebben ontwikkeld en meerdere jaren ervaring hebben in neuropathologie. Bij het bevriezen van de plakjes, worden ze op een voorgevooi aluminium lade en bedekt met een in elkaar grijpende aluminium plaat om ze goed plat te houden. Onmiddellijk daarna worden ze gedurende 3 minuten in vloeibare stikstof gestopt, voordat ze op -80 °C worden opgeslagen. De vast te stellen plakjes worden individueel verpakt in gaas en gedrenkt in een 10% fosfaatgebufferde formalineoplossing, die na één dag wordt vervangen. Vervolgens worden ze in formalin niet meer dan 5 extra dagen bewaard; gezien het feit dat de formaline oplossing doordringt op 1 mm/dag, willen we de wekende tijd verder verkorten.
Beperkingen van de methode
De hier beschreven onderzoeksmethode bestrijkt slechts een beperkt geografisch gebied en de personen die betrokken zijn bij het donatieprogramma bezitten kenmerken die niet volledig de algemene bevolking vertegenwoordigen. Hoewel meer dan aanvaardbaar, een postmortem interval tot 24 uur kan veranderingen veroorzaken in sommige eiwitstructuren, enzymen en RNA van hersenweefsel. De bepaling van AFS en pH is mogelijk niet helemaal toereikend voor het bepalen van de weefselkwaliteit73 en we ontwikkelen andere manieren om de weefselkwaliteit te verifiëren op basis van RNA-integriteit.
Wat de microtomesnijdensprocedure betreft, hoewel zeer nuttig voor het reconstrueren van anatomische relaties, moet worden opgemerkt dat het gebruik van macrosecties niet eenvoudig is en een aantal technische problemen met zich meebrengt. Onze methode is uitdagend en tijdrovend. De kosten zijn vrij hoog en de financiering is niet altijd gemakkelijk. De financiering komt voornamelijk uit het publiek (ASP Golgi-Redaelli Geriatrie Ziekenhuis) en particuliere middelen (Golgi-Cenci Foundation), particuliere donaties, non-profit organisaties (bijvoorbeeld “Federazione Alzheimer Italia”) en subsidies participatie.
Het belang van de ABB-methode met betrekking tot bestaande/alternatieve methoden
In het begin richtte ons hersendonatieprogramma zich op personen die deelnamen aan de InveCe.Ab longitudinale studie. Als gevolg hiervan gaan de gedoneerde hersenen vergezeld van gedetailleerde klinische, biologische en sociale informatie die in de loop der jaren is verzameld. De kracht van ABB ontleent juist aan deze onderscheidende oorsprong. Het bestuderen van een groep sociaal en genetisch verwante mensen die biologische kenmerken en blootstellingen aan het milieu delen, bevordert de statistische analyse. Bovendien omvat de studie de volgende voordelen: 1) Het verzorgen en voorzien in de behoeften van de gemeenschap (de handeling van “geven voordat het vraagt”): mensen krijgen een gratis periodieke controle waarvan de huisarts op de hoogte wordt gesteld, een telefoonnummer van onze secretaresse wordt verstrekt voor consultaties en ernstig gehandicapten thuis worden bezocht; 2) Het betrekken van deelnemers, mensen met openbare rollen en huisartsen bij educatieve activiteiten door middel van de organisatie van periodieke seminars (gerelateerd aan de gezondheid van de hersenen, hersendonatie en algemene gezondheid), en de planning van thematische cursussen (bijvoorbeeld het gebruik van informatietechnologie-apparaten voor ouderen); 3) Mensen ontmoeten en een persoonlijke benadering aannemen. Al deze elementen vormen de kracht van het ABB-project. Bovendien verbetert het project de klinische capaciteiten van betrokken medisch personeel, omdat het ervaring opdoet in zowel antemortem-beoordelingen als postmortem neuropathologische evaluaties. In dit verband willen we de zeer eigenaardige ervaring van “De minderheid veroudering onderzoek studie noemen”. Deze studie betrof een beperkt en geselecteerd aantal Afro-Amerikanen woonachtig in de omgeving van Chicago (784 van de 1.357 in aanmerking komende onderwerpen: respons van 57%). De deelnemers werden jaarlijks thuis bezocht en werden gevraagd om deel te nemen aan het hersendonatieprogramma. Deze studie is gebaseerd op een ongebruikelijke benadering met enkele gelijkenissen met de onze het verkrijgen van hoge percentages van positieve respons op de hersenen donatie programma (352 donoren van de 784 deelnemers waren ingeschreven: 44%), zij het autopsiepercentage was niet helemaal bevredigend (53%)74. Net als in “The minority aging research study” bieden wij educatieve activiteiten en een empathische aanpak, die uitstekende resultaten opleveren. In het bijzonder, onze respons is 93%, het inschrijvingspercentage is 28,7%, en het autopsiepercentage op dit moment is 67%. Deze percentages tonen aan dat projecten die mensen rechtstreeks betrekken een aanzienlijker percentage van de donaties hebben. Andere hersenen donatie programma’s, met minder aandacht voor het opbouwen van een relatie met potentiële donoren, hebben over het algemeen een laag inschrijvingspercentage, die ongeveer 10-15% of minder73,75.
Er zijn weinig eerdere cohortstudies die eindigen met een neuropathologische analyse. Bovendien, de meerderheid van de hersenen banken en repositories zijn ziekte-gecentreerd en er is een schaarste van “controle” hersenen van gezonde donoren in vergelijking met het aantal “zieke” hersenen. Slechts een beperkt aantal BB’s is gebaseerd op bevolkingsstudies waarbij zowel zieke als normale proefpersonen betrokken zijn om verouderingstrajecten73,74,76,77,78,,79,80te bestuderen . Sommige studies zoals “The minority aging research study” in de VS74 en “The Vantaa 85 + studie” in Finland76 zijn vergelijkbaar met de onze, maar ze hebben de neiging om op te raken met de beëindiging van het cohort. In plaats daarvan is het de bedoeling dat het donatieprogramma van ABB in de toekomst nog lang zal worden voortgezet, waarbij potentiële donoren worden ingeschakeld en follow-ups worden ingeperkt, zelfs na het einde van de longitudinale studie van InveCe.Ab. Deze aanpak maakt onze wervingsmethode vergelijkbaar met die van het “Sun Health Research Institute (SHRI) brain donation program” dat is gericht op een pensioen gemeenschap73. Het SHRI-protocol voor hersendonatie is zeer efficiënt met het kortste gemiddelde postmortem-interval ter wereld (3,92 uur). Net als bij de grootste BB’s ter wereld, de SHRI protocol gewoon gesneden de cerebrum, cerebellum en hersenstam in de middellijn (sagittale vlak), dan is de ene helft ontleed vers en bevroren voor biochemische studies, terwijl de andere is vastgesteld in formaline voor de histopathologische beoordeling. Echter, een van de sterke punten van de SHRI dissectie protocol is de fixatie van individuele plakjes in plaats van de hele hemisfeer. Inderdaad, het fixeren van een halfrond als geheel is niet optimaal, vanwege de verschillende fixatiegradiënten tussen het oppervlak en de kern. Bovendien kunnen de corticale eiwitten worden beïnvloed door langdurige blootstelling aan de formalineoplossing. Dus, de reden waarom we besloten om individuele plakjes vast te stellen.
De beslissing over welke kant is vastgesteld of bevroren, hangt af van de enkelvoud bank (altijd dezelfde, willekeurig toegewezen of toegewezen, afhankelijk van of de dag van dissectie is oneven of zelfs)31,32,33,34,35. Biochemische en histopathologische analyse worden dus afzonderlijk uitgevoerd op elk halfrond. Omdat veel neurologische ziekten asymmetrisch zijn, biedt onze BB een uniek protocol voor het snijden van verse exemplaren: alternatieve secties uit de hersenstam en van elk halfrond van cerebellum en cerebrum worden bewaard als vast of bevroren materiaal; een vast plak op één hemisfeer beantwoordt aan bevroren op de andere hemisfeer. Onze methode geeft de mogelijkheid om een volledige histologische karakterisering van alle bevroren materiaal te verkrijgen en de resultaten van alle gebieden van beide zijden te vergelijken. Zoals gezegd in de inleiding, de beschreven methode stelt ons in staat om zoveel mogelijk informatie te verkrijgen uit het hersenweefsel. Bovendien levert de methode van ABB een fundamentele maar volledige neuropathologische karakterisering op, waaronder bijna alle bekende herseneiwitopathieën en vasculaire pathologie. Vanwege de controversiële rol van vasculaire verwondingen bij het bepalen van cognitieve stoornissen, hebben we besloten om een dubbele score te gebruiken voor de vasculaire last30,53.
Zoals uitgelegd in het protocol, hanteren we een multidisciplinaire aanpak. Hoewel dit een tijdrovende en moeizame methode is, geloven we dat het verschillende voordelen biedt voor onderzoek. Bijvoorbeeld, in een eerder werk, hebben we aangetoond dat hoge tHcy per se, of MTHFR C677T TT in verband met de APOE-ε4 allel, kan worden gerelateerd aan uitvoerende disfuncties in plaats van geheugenverlies81. Daarom kan het interessant zijn om proefpersonen met dit specifieke genetische profiel op neuropathologisch niveau te evalueren. Dit is een voorbeeld van hoe een dergelijke diepgaande follow-up nuttig is bij het creëren van nieuwe onderzoekshypothesen verifieerbaar door onderzoek van biologisch materiaal verzameld in onze bank. Een andere demonstratie van het voordeel van onze aanpak is de opname van QEEG in de beoordelingen die we routinematig uitvoeren, voor de originaliteit en het relatieve gebruiksgemak. Inderdaad, EEG detecteert de synaptische activiteit van de hersenschors door het registreren van de elektrische mogelijkheden van dendrieten die behoren tot corticale piramidale neuronen82. QEEG kan worden beschouwd als een biomarker voor de schatting van corticale synaptische activiteit die gerelateerd is aan cognitie83. In het bijzonder is een afname van alfaritmes in het achterste deel van de hersenen met een algemene toename van lagere frequenties (theta- en deltaritmes) gerelateerd aan corticale verbindingsverdeling. Er moet worden aangenomen dat de meeste diagnostische correlatiestudies zijn gebaseerd op een klinische diagnose die slechts een waarschijnlijke en niet-definitieve diagnose is84,85,86,87. Slechts zeer weinig gerichte studies hebben QEEG-gegevens vergeleken met het neuropathologische beeld om de correlatie tussen QEEG- en LTS-varianten88,89,en het onderscheid tussen FTLD en AD83te onderzoeken . Door onze studie te beëindigen met een definitie van de neuropathologische diagnose, is het dan mogelijk om de waarnemingen van de cerebrale elektrische activiteit correct te interpreteren. Bovendien kunnen we bij het uitvoeren van seriële QEEG in elk onderwerp intra-individuele EEG-golven traject en hun correlaties met het neuropathologische beeld volgen. Na individuele wijzigingen van corticale elektrische activiteit na verloop van tijd kan leiden tot een beter begrip van de betekenis ervan als een biomarker voor beginnende dementie.
Toekomstige toepassingen en richting van de methode
De uitvoering van de weefseldistributie is een van onze belangrijkste prospectieve doelen. Om dit te doen, hebben we net een wetenschappelijke commissie opgericht met inbegrip van de directeur van de GC Foundation (geriater), een academicus van neurologie van de Universiteit van Pavia, een neuroloog en een patholoog zowel van de GC Foundation & de Geriatrisch Ziekenhuis ASP Golgi-Redaelli. Bij de distributie van hersenweefsel, histologische dia’s en andere biologische monsters, is het belangrijk om te onthouden dat donoren ingestemd met de donatie omwille van het onderzoek. De distributie van materiaal moet daarom voorzichtig plaatsvinden, zoals beschreven in de BNE-gedragscode40. Elke partij die een aanvraag om materiaal indient, moet het type en de hoeveelheid van het benodigde monster vermelden, een beschrijving geven van het onderzoeksproject en hoe de monsters zullen worden gebruikt en waar mogelijk bewijs leveren van eerdere publicaties (voor de overdrachtsovereenkomst, zie figuur 9). De hersenbank werkt niet voor financieel gewin. De door onderzoekers betaalde vergoedingen mogen dus alleen de kosten dekken van de inkoop, verwerking, opslag en distributie van weefsels.
Plannen om te beginnen met het analyseren van gevallen met exome sequencing en Omics technieken, zoals proteomics en transcriptomics, zijn in beweging. Onze alternatieve bemonsteringsmethodologie zal het mogelijk maken omics studies uit te voeren op histologisch goed gedefinieerde weefsels van beide hemisferen. Door deze benadering zal het mogelijk zijn om het patroon van genactivering in verschillende hersengebieden van hetzelfde halfrond en in de overeenkomstige gebieden van het andere halfrond te vergelijken en genactivatie te correleren met histopathologie. Op dit gebied zouden deep learning-toepassingen van groot belang zijn, waaronder geautomatiseerde analyse van histologische dia’s en een geavanceerde correlatie van klinische, histologische en omics gegevens. Andere correlaties tussen veel verschillende variabelen kunnen worden geïdentificeerd, evenals andere mogelijke technologische toepassingen. De beschikbaarheid van bevroren materiaal van beide hemisferen zal een nauwkeurige topografie van genactivering en eiwitdistributie mogelijk maken. Dit zal van bijzonder belang zijn, zelfs bij gezonde proefpersonen, gezien het feit dat zowel hersenfuncties als sommige ziekten asymmetrisch zijn.
Bovendien kunnen we celculturen verkrijgen van goed gekarakteriseerde hersendonoren. Celculturen uit de leptomeninges van geoogste hersenen leveren levende cellen die kunnen worden gebruikt voor verder onderzoek van ziekten of verouderingsmechanismen, door middel van de geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) technologie die leptomeningeale fibroblasten herprogrammeert en ze in neurale cellen in geavanceerde modellen90onderscheidt.
Naarmate de hersenen ouder worden, kunnen verschillende profielen van verandering optreden op moleculair, cellulair en weefselniveau. Elk brein is uniek. Elk heeft zijn eigen manier van reageren op interne en externe stressoren; sommige verzetten zich terwijl anderen bezwijken en vertonen verschillende pathologieën. Discrepanties tussen de klinische presentatie en het neuropathologische beeld bestaan vaak omdat de topografie van de laesies, in plaats van hun moleculaire aard, de klinische presentatie bepaalt. De juiste en definitieve diagnose kon alleen worden bereikt door het klinische syndroom te combineren met de neuropathologische bevindingen die vaak belangrijke etiologische aanwijzingen toevoegen die nodig zijn om de pathogenese van de ziekten te ontrafelen. In Europa wordt gewerkt aan een standaardbenadering van neuropathologische diagnose. Ons diagnostisch protocol volgt bijna volledig de onlangs gepubliceerde richtlijnen over neuropathologische diagnose voor hersenbankieren91. Dit zal ons toelaten om goed gedocumenteerd hersenweefsel te verzamelen en te delen, met het toekomstige doel om de eerste Italiaanse Hersenbank op te richten. Inderdaad, in Italië zijn er hersenen repositories, maar niet hersenen banken op basis van cohort studies. Ons doel is om een methode te ontwikkelen voor het oogsten van hersenweefsel die breed kan worden geïmplementeerd in heel Italië, om een netwerk op te zetten dat gebruik maakt van een gemeenschappelijk protocol en vergelijkbaar materiaal deelt. Om dit te doen, de betrokkenheid van andere onderzoekscentra en de oprichting van een specifieke website behoren tot de belangrijkste doelstellingen voor de toekomst.
Innovatieve technologieën worden voortdurend gebruikt voor de analyse van de moleculaire aard van neurodegeneratieve ziekten en voor biomarker identificatie. In deze context zal er een toenemende behoefte aan hersenen gepaard gaan met informatie over cognitieve en verouderingstrajecten verkregen door longitudinale studies, waarbij het belang van een neuropathologisch geverifieerde epidemiologische benadering92wordt benadrukt.
The authors have nothing to disclose.
We willen dit werk opdragen aan Dr.ssa Michela Mangieri. Voordat ze voortijdig stierf, bedacht en begon ze het Abbiategrasso Brain Bank Project.
We zijn onze hersendonoren dankbaar, die genereus bijdragen aan onderzoek dat het edelste orgaan van hun lichaam doneert; zonder hen zou dit onderzoek niet mogelijk zijn.
We zijn Valeria Marzagalli dankbaar voor haar kostbare werk in het ABB-project.
De auteurs danken prof. Johannes Attems, dr. Paolo Fociani en dr. Giorgio Giaccone voor hun kostbare begeleiding en wijze raad.
We willen Dr.ssa Alice Cirrincione en Miss Giulia Bortone bedanken voor hun kostbare hulp tijdens het hele project.
Veel dank aan mevrouw Tere Cassani voor haar steun en “Federazione Alzheimer Italia” voor haar samenwerking.
De auteurs zijn dr. Matteo Moretti en prof. Antonio Marco Maria Osculati, department of Public Health, Experimental and Forensic Medicine, Universiteit van Pavia dankbaar.
50ml polypropilene conical tube 30x115mm | BD | 405253 | |
Anti-GFAP | Dako | Z0334 | policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000 |
Anti-NeuN (A60) | Chemicon | MAB377 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000 |
Anti-phospho TAU (AT8) | ThermoScientific | MN1020 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200 |
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2) | CosmoBio | TIP-PTD-P02 | policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 |
Anti-α-SYN (KM51) | Novocastra | NCL-L-ASYN | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min |
Anti-βamyloid (4G8) | BioLegend | 800703 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min |
Cutting board | BD | 352070 | |
DMEM High Glucose | Carlo Erba | FA30WL0101500 | medium |
Electrical saw with 5d blade | CEA | 06.06.14/06.00.16 | |
Electrode pH measure surface 12mm | CEA | 70064.250 HHH | |
Electrode pH needle | Fisher Scientific | 11796338 | |
EnVision+System-HRP | Dako | K4001 | secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2 |
EnVision+System-HRP | Dako | K4003 | secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2 |
Ethylether | SMI | 8401530 | |
Feather safety trimming knife blade 14cm | Fisher Scientific | 11749798 | |
Fetal Bovine Serum | Carlo Erba | FA30WS1810500 | medium supplement; dilution = 20% |
Forceps 15cm surgical or anatomical | Uvex | 500XG | |
Gloves | CEA | 01.28.14 | |
Glue | Arcobaleno | 2624000800002 | |
Head supporter | Lacor | 60456 | |
L-Glutamine (100X) | Carlo Erba | FA30WX0550100 | medium supplement; dilution = 1% |
Measuring tape | CEABIS | CEATA34 | |
Non adsorbable monofilament black polyamide | UHU Bostik | 8000053131470 | |
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140050 | medium supplement; dilution = 1% |
Pen/Strept Solution (100X) | Carlo Erba | FA30WL0022100 | medium supplement; dilution = 1% |
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm | CEA | 03.06.16 | |
Sterile scalpel with n°21 blade | |||
Surgical basin | Olcelli Farmaceutica | A930857255 | |
Surgical mallet and surgical cisel | CEA | 79.68.88 | |
Surgical scissor | CEA | 27.08.45/79.68.64 | |
Feather | M130RC |