Questo protocollo descrive un metodo per monitorare le singole traiettorie di invecchiamento cerebrale attraverso un programma di donazione di cervello e la corretta caratterizzazione del cervello. I donatori di cervello sono coinvolti in uno studio longitudinale a lungo termine che include valutazioni multidimensionali seriali. Il protocollo contiene una descrizione dettagliata dell’elaborazione del cervello e una metodologia diagnostica accurata.
In una popolazione in costante invecchiamento, la prevalenza di disturbi neurodegenerativi è previsto per aumentare. Comprendere i meccanismi della malattia è la chiave per trovare misure preventive e curative. Il modo più efficace per raggiungere questo obiettivo è attraverso l’esame diretto del tessuto cerebrale magro e sano. Gli autori presentano un protocollo per ottenere, elaborare, caratterizzare e memorizzare tessuto cerebrale di buona qualità donato da individui registrati in un programma di donazione del cervello antemortem. Il programma di donazione include un approccio empatico faccia a faccia verso le persone, una raccolta di informazioni cliniche, biologiche, sociali e di stile di vita complementari e valutazioni multidimensionali seriali nel tempo per monitorare le singole traiettorie del normale invecchiamento e del declino cognitivo. Poiché molte malattie neurologiche sono asimmetriche, la nostra banca del cervello offre un protocollo unico per affettare campioni freschi. Le sezioni cerebrali di entrambi gli emisferi sono alternativamente congelate (a -80 gradi centigradi) o fissate in formalina; una fetta fissa su un emisfero corrisponde a una congelata sull’altro emisfero. Con questo approccio, è possibile ottenere una caratterizzazione istologica completa di tutto il materiale congelato e gli studi omici possono essere eseguiti su tessuti istologicamente ben definiti da entrambi gli emisferi offrendo così una valutazione più completa dei meccanismi della malattia neurodegenerativa. Una diagnosi corretta e precisa di queste malattie può essere ottenuta solo combinando la sindrome clinica con la valutazione neuropatologica, che spesso aggiunge importanti indizi eziologici necessari per interpretare la patogenesi. Questo metodo può richiedere tempo, costoso e limitato in quanto copre solo un’area geografica limitata. Indipendentemente dai suoi limiti, l’alto grado di caratterizzazione che fornisce può essere gratificante. Il nostro obiettivo finale è quello di istituire la prima Banca Italiana del Cervello, sottolineando nel contempo l’importanza degli studi epidemiologici neuropatologicalmente verificati.
Secondo l’OMS, circa 50 milioni di persone soffrono attualmente di demenza, una cifra che si prevede triplicherà entro il 2050. Il morbo di Alzheimer è la principale causa di demenza, seguita da malattia cerebrovascolare e altri disturbi neurodegenerativi legati all’età. Nel 2017, l’OMS ha sviluppato l’Osservatorio globale sulla demenza per aumentare la consapevolezza della demenza e incoraggiare un piano d’azione globale contro diessa 1. Ogni individuo ha la propria traiettoria di invecchiamento cerebrale, quindi la ricerca della cura può essere difficile a causa della complessità della patogenesi delle malattie neurodegenerative. Forse, ogni persona possiede la propria patogenesi scritta nel tessuto cerebrale che richiede un approccio personalizzato. Così, lo studio del tessuto cerebrale sarà la chiave per comprendere i meccanismi della neurodegenerazione.
Ripensando alla storia delle neuroscienze, ci rendiamo conto che le scoperte più impressionanti e rivoluzionarie non avrebbero mai potuto essere verificate senza l’esame diretto del cervello umano. Nel corso del tempo, la fonte di tessuto cerebrale da studiare è cambiata da dissezioni grezze, “incontri casuali” e, in alcuni casi, commercio illegale, a raccolte di cervelli organizzate e banche strategiche del cervello moderno. La considerazione di molti aspetti etici è uno dei principali fattori che differenziano le banche del cervello moderno dalle collezioni cerebrali del passato. Le prime vere e moderne Brain Banks (BB) sono state istituite nella seconda metà delXX secolo. Nicholas Corsellis e Wallace Tourtelotte possono essere considerati pionieri del moderno brain banking. Nel Regno Unito, Corsellis ha assemblato una collezione che contiene oltre 1000 cervelli ben documentati affetti da vari disturbi mentali e neurologici2. Inoltre, Corsellis ha contribuito a rivelare la necessità di preservare il tessuto cerebrale fresco nel ghiaccio per il bene dei test biochimici3. Nel frattempo negli Stati Uniti, Wallace Tourtelotte ha introdotto programmi di donazione cerebrale antemortem per facilitare la sollecitazione di potenziali donatori di cervello e garantire che i cervelli raccolti siano accompagnati da una storia medica e neurologicacompleta 4,5. Per una panoramica storica delle collezioni di cervelli e dei BC moderni, vedere Carlos et al. 6.
Allora, perché abbiamo ancora bisogno di cervelli umani? Le malattie cerebrali possono essere date solo una diagnosi definitiva dopo l’esame neuropatologico. La neuropatologia sfida la diagnosi clinica ed è la chiave per una corretta interpretazione dei sintomi clinici e per la scoperta delle basi istologiche di nuove varianti sidromiche. Infatti, la diagnosi può essere ridefinita in base al quadro patologico. Ciò nonostante, il tasso di autopsia è diminuito negli ultimi decenni a causa del recente sviluppo di tecniche di neuroimaging innovative. Attraverso l’imaging cerebrale, le alterazioni morfologiche, funzionali e metaboliche nel cervello, così come l’entità del misfolding delle proteine, possono essere valutate in vivo. Tuttavia, il neuroimaging in vivo e altri studi sui biomarcatori possono solo dare una “stima” del quadro patologico in quanto non sono in grado di rilevare sottili cambiamenti cellulari e molecolari. I progressi nell’imaging molecolare e nella scoperta di nuovi biomarcatori, molecole bersaglio e traccianti7 (ad esempio, amiloidi, TAU, traccianti microgliali) rendono il cervello umano ancora più indispensabile per l’interpretazione dei dati ottenuti dalle valutazioni cliniche e dai test sui biomarcatori. Inoltre, le tecnologie omiche (genomica, epigenomica, trascrittiomica, metabolomica, proteomica, lipidomica, ecc.), eseguita su tessuto cerebrale fresco e congelato, ha aperto nuove possibilità per comprendere i meccanismi della malattia e scoprire i geni a rischio, nuovi marcatori diagnostici e prognostici, e potenziali bersagli farmacologici8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
Per questi scopi, i moderni BB archiviano tessuti cerebrali ben caratterizzati e di alta qualità rendendoli disponibili per la comunità scientifica3,24. I cervelli forniti dai BB devono essere accompagnati da una storia clinica completa. L’attività di un BB comprende quanto segue: (1) Riconoscimento e reclutamento di individui mati e sani a programmi di donazione di cervelli; la condizione ideale sarebbe raggiungere un follow-up multidisciplinare dei donatori per tutta la vita per ottenere una storia clinica, di stile di vita e sociale completa e profili di biomarcatori; infatti, riserva cognitiva e struttura del cervello dipendono da stile di vita e fattori socio-educativi25,26, quindi queste informazioni arricchiscono i dati totali a portata di mano. (2) Acquisizione del cervello (costituito da cerebrum, cervelletto e stelo cerebrale) e tessuti correlati (ad esempio, midollo spinale, nervi cranici e gangli, ecc.) in seguito alla scomparsa del donatore, osservando nel contempo norme legali ed etiche standardizzate. (3) Elaborazione appropriata (dissezione, fissazione, congelamento) del cervello, come definito in un protocollo operativo standardizzato, per ottenere tessuto di alta qualità e consentire un uso futuro nella ricerca multidisciplinare. (4) Caratterizzazione neuropatologica dettagliata che fornisce una diagnosi definitiva. (5) Stoccaggio e distribuzione di materiale tissu/tessuto alla comunitàdi ricerca 27,28.
Tutti i BB immagazzinano tessuti incorporati congelati e formalin-fixed-paraffin. Ogni BB ha un proprio protocollo. Fatta eccezione per studi particolari, come il protocollo di taglio bihemisferico del Biomedical Research Institute (New Jersey)29 e lo studio del Deramecourt sulla patologia cerebrovascolare30, i più grandi BB del mondo semplicemente tagliare il cervello, cervelletto e tronco encefalico lungo la linea mediana (piano sagittale). Una metà viene sezionata fresca e poi congelata per studi biochimici, mentre l’altra è fissata in formalina per la valutazione itopatologica. Quindi, le analisi biochimiche e ipatologiche vengono condotte separatamente su ogni emisfero. La decisione su quale lato è fisso o congelato (lateralità), dipende dalla singolare banca31,32,33,34,35. Poiché molte malattie neurologiche sono asimmetriche, il nostro BB offre un protocollo unico per affettare cervelli freschi: sezioni adiacenti del tronco encefalico e ogni emisfero sono alternativamente fisse e congelate; una fetta fissa su un emisfero corrisponde a una congelata sull’altro emisfero. Attraverso questo metodo, l’uso del tessuto cerebrale è ottimizzato, e una caratterizzazione istologica completa di tutto il materiale congelato può essere raggiunta con la possibilità di ottenere e confrontare informazioni istologiche e biochimiche da tutte le aree di entrambi gli emisferi.
La cornice del nostro progetto di banca del cervello è la città di Abbiategrasso. Abbiategrasso è una piccola città a circa 22 km a sud-ovest della città di Milano, nel nord Italia. Ha una popolazione di circa 32.600 persone. Ospita la Fondazione Golgi-Cenci (GC). La Fondazione GC fa parte di un grande Ospedale Geriatrico di Riabilitazione (ASP Golgi-Redaelli), ed è un istituto che si concentra sulla ricerca sull’invecchiamento e la cura degli anziani. In particolare, si concentra sullo studio dell’invecchiamento mentale, dei fattori sociali e comportamentali che lo influenzano e della biologia e della patologia alla base dei disturbi neurocognitivi dipendenti dall’età (NCD). Nel 2009, la Fondazione GC ha lanciato un nuovo studio longitudinale con 1321 partecipanti (su 1644 soggetti ammissibili: tasso di risposta iniziale dell’80,3%) nato tra il 1935 e il 1939 (di età compresa tra i 70 e i 75 anni), di etnia caucasica, che vive nella stessa piccola area geografica. Lo studio si chiamava InveCe.Ab (Invecchia cchiamento Cerebrale Abbiategrasso; in inglese: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) ed è attualmente in corso. InveCe.Ab è prevista per ottenere una coorte con massima omogeneità e meno variabilità al fine di valutare l’incidenza, la prevalenza e la storia naturale della demenza, insieme ai suoi possibili fattori di rischio o protettivi, tra cui variabili comportamentali, psicosociali, cliniche e biologiche36. Le caratteristiche della coorte sono illustrate nelle figure 1 e nella tabella 1. I dati epidemiologici sono coerenti con la tendenza della demenza nella popolazione europea37,,38 e invece.Ab partecipanti hanno caratteristiche genetiche e ambientali omogenee, che rappresentano un buon modello per studiare la traiettoria dal normale invecchiamento ai disturbi neurocognitivi. Infatti, le popolazioni omogenee richiedono meno soggetti per raggiungere un adeguato potere statistico. La metodologia InveCe.Ab è già stata riportataaltrove 36, ma è importante sottolineare il suo approccio multidimensionale attraverso controlli periodici (ogni 2-3 anni) utilizzando lo stesso insieme di valutazioni tra cui: campionamento del sangue (pannello metabolico, omocisteina e vitamine, estrazione del DNA per profilo Apolipoproteina E (APOE) e altri polimorfismi genetici legati alla cognizione e all’invecchiamento), misurazioni antropometriche (peso, altezza e vita), Talking While Walking Test (dual task test), un’intervista per valutare lo stile di vita (aderenza alla dieta mediterranea, livelli di attività fisica e impegno cognitivo) e fattori sociali (coinvolgimento sociale, solitudine), un esame clinico Confrontare tali dati longitudinali con i dati neuropatologici postmortem sarebbe fondamentale per la ricerca. Pertanto, il nostro team e in particolare la dott.ssa Michela Mangieri hanno concepito l’approccio neuropatologico di cui sopra. Dal 2014 e durante il secondo follow-up, ai partecipanti inVeCe.Ab è stato chiesto di donare il loro cervello, portando così alla nascita della Abbiategrasso Brain Bank (ABB). I principali donatori di ABB sono i partecipanti InveCe.Ab, ma ABB è ora aperta ad altri donatori volontari. Sono pazienti di ASP Golgi-Redaelli, che ospitano diversi pazienti affetti da diverse malattie neurologiche o volontari adulti che imparano a conoscere il Progetto ABB e appartengono alla stessa area geografica (Abbiategrasso e dintorni). Tutti i donatori sono sottoposti allo stesso protocollo di valutazione.
Gli autori propongono un metodo per tracciare le singole traiettorie del normale invecchiamento e la possibile progressione verso gli NCD, e per gestire, elaborare e caratterizzare con precisione i cervelli acquisiti da tali donatori seguiti longitudinalmente. Inoltre, il nostro obiettivo è quello di incontrare e coinvolgere gli individui in valutazioni neurologiche periodiche, seminari e attività educative per quanto riguarda il benessere del cervello e per aumentare la loro consapevolezza della donazione di cervello per scopi di ricerca.
Passaggi critici del protocollo
Il nostro obiettivo è quello di ottenere, caratterizzare e conservare tessuti di buona qualità provenienti da soggetti con una storia dettagliata derivata dall’osservazione longitudinale. Per raggiungere questo obiettivo, è necessario affrontare i seguenti aspetti chiave. Come descritto in precedenza, il protocollo inizia con il reclutamento di donatori, che è il primo passo cruciale. Quindi, è necessario che i donatori continuino il programma di follow-up e mantengano l’adesione al progetto nel tempo fino all’effettiva donazione del cervello. Al momento del decesso, è necessario che il personale ABB sia tempestivamente informato per convocare l’autopsia entro 24 ore, essendo importante per un’adeguata qualità dei tessuti. Il taglio fresco degli emisferi cerebrali richiede una mano ferma e un allenamento specifico. Per evitare danni cellulari causati da congelamento lento e ottenere fette di buona qualità per il criostato e l’Omics, è importante che siano congelati rapidamente. Considerando la velocità di penetrazione della soluzione di formalina (1 mm/ora), per preservare l’antigenicità tissunte il tempo di ammollo della singola fetta viene mantenuto al minimo.
Risoluzione dei problemi del metodo
Al fine di affrontare i passaggi critici di cui sopra offriamo il seguente approccio. Reclutamento dei donatori e aderenza ai follow-up: Ci sono diversi fattori che ostacolano la donazione del cervello, tra cui i timori di danneggiare la figura del corpo, la purezza e l’integrità, o della possibilità di provare dolore dopo la morte. Alcuni temono addirittura che l’autopsia possa essere condotta mentre sono ancora vivi70,71. Sono inoltre presenti 72 preoccupazioni circa l’interruzione degli accordi funebrie l’onere finanziario. Inoltre, la mancanza di conoscenza da parte del personale medico delle procedure post-mortem e l’incapacità di affrontare le preoccupazioni dei potenziali donatori o del loro NOK possono scoraggiare la registrazione. Tutti questi fattori possono produrre un basso livello di consapevolezza con un basso numero di partecipanti iscritti e un’alta possibilità di perdita del donatore nel tempo. In effetti, il programma di reclutamento dei donatori dovrebbe essere efficace nel diffondere la consapevolezza, infondere fiducia e convincere le persone a registrarsi e mantenere alti tassi di partecipazione al follow-up. Nella nostra esperienza, questo viene fatto attraverso un’attenta selezione di potenziali donatori e una spiegazione approfondita degli scopi del BB. Offriamo attività educative e un approccio empatico per affrontare le paure e le esigenze delle persone sane e delle persone afflite e delle loro famiglie. Troviamo che i potenziali donatori sono più propensi a dare il loro consenso quando vengono contattati di persona. Un approccio faccia a faccia crea una relazione basata sulla fiducia reciproca e sul rispetto che è fondamentale per ottenere un’alta percentuale di registrazione alle donazioni cerebrali e valutazioni di follow-up. Uno staff altamente qualificato con un forte senso dell’etica si avvicina prima al potenziale donatore, discute la possibilità di donare il cervello dopo la morte, spiega il valore del tessuto cerebrale umano alla ricerca neuroscientifica e chiarisce ogni dubbio sulle procedure post-mortem. Il passaparola favorevole è altrettanto importante. Dopo la raccolta del cervello, viene prestata un’attenzione e una cura adeguate per ricomporre il cadavere. È importante mostrare rispetto e gratitudine alla persona deceduta trattando delicatamente il cadavere. Pochi mesi dopo, è previsto un incontro per comunicare i risultati dell’analisi neuropatologica ogni volta che richiesto dai membri della famiglia.
L’ora del decesso e la raccolta del cervello: Quando la persona accetta, diventa un donatore e viene data una carta d’identità con un numero da contattare 24 ore al giorno, 7 giorni /settimana (il numero di ricezione dell’ospedale geriatrico ASP Golgi-Redaelli che è collegato a noi). Inoltre, un’etichetta adesivo viene data ai parenti da utilizzare in caso di ricovero in ospedale. Le agenzie funebri della zona sono state precedentemente informate per portare il corpo nelle strutture ABB, dove viene convocata la squadra di autopsia. L’unità di autopsia è composta da un patologo, un neurologo e/o un neurobiologo, e un tecnico di sala anatomica, che sono a chiamata dalle 6:00 alle 23:00 ogni giorno; alcuni studenti tirocinanti sono spesso presenti per assistere e scattare foto.
La precisione e la coerenza delle nuove procedure di taglio sono garantite dal coinvolgimento degli stessi due operatori (un neurologo e un patologo) che hanno sviluppato il metodo e hanno diversi anni di esperienza in neuropatologia. Quando congelano le fette, vengono messe su un vassoio di alluminio prefrozen e coperte con una piastra di alluminio intrecciata per mantenerle ben piatte. Immediatamente dopo, vengono messi in azoto liquido per 3 minuti, prima di conservarli a -80 gradi centigradi. Le fette da sistemare sono avvolte singolarmente in garza e imbevute in una soluzione di formalina tamponata al 10% di fosfato, che viene sostituita dopo un giorno. Successivamente, sono tenuti in formalin non più di 5 giorni aggiuntivi; tuttavia, considerando che la soluzione formalina penetra a 1 mm/giorno, vorremmo accorciare ulteriormente il tempo di ammollo.
Limitazioni del metodo
Il metodo di ricerca qui descritto copre solo un’area geografica limitata, e gli individui coinvolti nel programma di donazione possiedono caratteristiche che non rappresentano interamente la popolazione generale. Anche se più che accettabile, un intervallo post-mortem fino a 24 ore può produrre alterazioni in alcune strutture proteiche, enzimi e RNA del tessuto cerebrale. La determinazione di AFS e pH potrebbe non essere del tutto adeguata per determinare la qualità del tessuto73 e stiamo sviluppando altri modi di autenticare la qualità dei tessuti in base all’integrità dell’RNA.
Per quanto riguarda la procedura di taglio dei microtomi, anche se molto utile per ricostruire le relazioni anatomiche, va notato che l’uso di macrosezioni non è semplice e presenta alcune difficoltà tecniche. Il nostro metodo è impegnativo e richiede molto tempo. I costi sono piuttosto elevati e il finanziamento non è sempre facile. Il finanziamento proviene principalmente da fonti pubbliche (OSPEDALE Geriatrico ASP Golgi-Redaelli) e private (Fondazione Golgi-Cenci), donazioni private, organizzazioni no profit (ad esempio “Federazione Alzheimer Italia”) e sovvenzioni alla partecipazione.
L’importanza del metodo ABB rispetto ai metodi esistenti/alternativi
All’inizio, il nostro programma di donazione di cervelli ha preso di mira le persone che partecipano allo studio longitudinale InveCe.Ab. Di conseguenza, i cervelli donati sono accompagnati da informazioni cliniche, biologiche e sociali dettagliate raccolte nel corso degli anni. La forza di ABB deriva proprio da questa origine distintiva. Infatti, studiare un gruppo di persone socialmente e geneticamente correlate che condividono caratteristiche biologiche ed esposizioni ambientali migliora l’analisi statistica. Inoltre, lo studio comprende i seguenti vantaggi: 1) Prendersi cura e provvedendo alle esigenze della comunità (l’atto di “dare prima di chiedere”): le persone ricevono un controllo periodico gratuito di cui il medico generico è informato, un numero di telefono del nostro segretario è previsto per le consultazioni e le persone gravemente disabili sono visitate a casa; 2) coinvolgere i partecipanti, le persone con ruoli pubblici e i medici generici nelle attività educative attraverso l’organizzazione di seminari periodici (relativi alla salute del cervello, alla donazione del cervello e alla salute generale) e alla pianificazione di corsi tematici (ad esempio l’uso di dispositivi ittici per anziani); 3) Incontrare le persone e adottare un approccio faccia a faccia. Tutti questi elementi costituiscono la forza del progetto ABB. Inoltre, il progetto migliora le capacità cliniche del personale medico coinvolto, in quanto acquisiscono esperienza sia nelle valutazioni antemortem che nelle valutazioni neuropatologiche post-mortem. A questo proposito, vorremmo menzionare l’esperienza molto particolare di “Lo studio di ricerca sull’invecchiamento delle minoranze”. Questo studio ha coinvolto un numero limitato e selezionato di afroamericani residenti nell’area di Chicago (784 su 1.357 soggetti ammissibili: tasso di risposta del 57%). I partecipanti sono stati visitati ogni anno a casa e sono stati invitati a partecipare al programma di donazione del cervello. Questo studio si basa su un approccio insolito con alcune somiglianze con la nostra ottenendo alte percentuali di risposta positiva al programma di donazione del cervello (352 donatori su 784 partecipanti sono stati iscritti: 44%), anche se il tasso di autopsia non era abbastanza soddisfacente (53%)74. Proprio come in “The minority aging research study”, offriamo attività educative e un approccio empatico, ottenendo ottimi risultati. In particolare, il nostro tasso di risposta è del 93%, la percentuale di iscrizione è del 28,7% e il tasso di autopsia al momento è del 67%. Questi tassi mostrano che i progetti che impegnano direttamente le persone hanno una percentuale più consistente di donazioni. Altri programmi di donazione del cervello, con meno attenzione nella costruzione di una relazione con i potenziali donatori, hanno generalmente una bassa percentuale di iscrizione, essendo intorno al 10-15%o meno 73,75.
Ci sono pochi studi di coorte precedenti che terminano con un’analisi neuropatologica. Inoltre, la maggior parte delle banche cerebrali e repository sono centrato sulla malattia e c’è una scarsità di cervelli “di controllo” da donatori sani rispetto al numero di cervelli “malattia”. Solo un numero limitato di BB si basa su studi di popolazione che coinvolgono soggetti sia matidi che normali al fine di studiare le traiettoriedi invecchiamento 73,74,76,77,78,79,80. Alcuni studi come “The minority aging research study” negli Stati Uniti74 e “The Vantaa 85′ studio” inFinlandia 76 sono simili al nostro, ma tendono a esarsi con la cessazione della coorte. Invece, il programma di donazione di ABB è previsto per continuare per lungo tempo in futuro, arruolando potenziali donatori e programmando follow-up anche dopo la fine dello studio longitudinale InveCe.Ab. Questo approccio rende il nostro metodo di reclutamento simile a quello del “Sun Health Research Institute (SHRI) programma di donazione del cervello” che si rivolge a una comunità di pensionamento73. Il protocollo SHRI per la donazione di cervelli è molto efficiente con l’intervallo post-mortem medio più breve al mondo (3,92 ore). Simile ai più grandi BB del mondo, il protocollo SHRI ha semplicemente tagliato il cervello, il cervelletto e il tronco encefalico nella linea mediana (piano sagittale), quindi una metà viene sezionata fresca e congelata per gli studi biochimici, mentre l’altra è fissata in formalina per la valutazione istopatologica. Tuttavia, uno dei punti di forza del protocollo di dissezione SHRI è la fissazione di singole fette invece dell’intero emisfero. Infatti, fissare un emisfero nel suo complesso non è ottimale, a causa dei diversi gradienti di fissazione tra la superficie e il nucleo. Inoltre, le proteine corticali possono essere influenzate dall’esposizione prolungata alla soluzione di formalina. Così, il motivo per cui abbiamo deciso di fissare singole fette.
La decisione su quale lato è fisso o congelato, dipende dalla singolare banca (sempre la stessa, assegnata o assegnata in modo casuale a seconda che il giorno della dissezione sia dispari o pari)31,32,33,34,35. Quindi, l’analisi biochimica e istopatologica sono condotte separatamente su ogni emisfero. Poiché molte malattie neurologiche sono asimmetriche, il nostro BB offre un protocollo unico per affettare campioni freschi: sezioni alternative dal tronco encefalico e da ogni emisfero di cervelletto e cerebrum vengono mantenute come materiale fisso o congelato; una fetta fissa su un emisfero corrisponde a una congelata sull’altro emisfero. Il nostro metodo dà l’opportunità di ottenere una caratterizzazione stologica completa di tutto il materiale congelato e di confrontare i risultati di tutte le aree di entrambi i lati. Come detto nell’introduzione, il metodo descritto ci permette di ottenere il maggior numero possibile di informazioni dal tessuto cerebrale. Inoltre, il metodo di ABB produce una caratterizzazione neuropatologica di base ma completa, tra cui quasi tutte le proteine cerebrali conosciute e la patologia vascolare. A causa del controverso ruolo delle lesioni vascolari nel determinare il danno cognitivo, abbiamo deciso di utilizzare un doppio punteggio per l’onere vascolare30,53.
Come spiegato nel protocollo, usiamo un approccio multidisciplinare. Anche se questo è un metodo che richiede tempo e lavorato, crediamo che fornisce diversi vantaggi per la ricerca. Per esempio, in un lavoro precedente, abbiamo dimostrato che l’alto tHcy di per sé, o MTHFR C677T TT associato all’allele APOE-4, può essere correlato a disfunzioni esecutive piuttosto che alla perdita dimemoria 81. Pertanto, può essere interessante valutare soggetti con questo particolare profilo genetico a livello neuropatologico. Questo è un esempio di come tale follow-up approfondito sia utile per creare nuove ipotesi di ricerca verificabili attraverso lo studio del materiale biologico raccolto nella nostra banca. Un’altra dimostrazione del vantaggio del nostro approccio è l’inclusione del QEEG tra le valutazioni che eseguiamo regolarmente, per la sua originalità e la relativa facilità d’uso. Infatti, EEG rileva l’attività sinaptica della corteccia cerebrale registrando i potenziali elettrici dei dendriti appartenenti ai neuroni piramidali corticali82. QEEG può essere considerato un biomarcatore per la stima dell’attività sinaptica corticale che è legata alla cognizione83. In particolare, una diminuzione dei ritmi alfa nella parte posteriore del cervello con un aumento generale delle frequenze più basse (ritmi theta e delta) è stata correlata alla rottura della connessione corticale. Va considerato che la maggior parte degli studi di correlazione diagnostica sono stati basati su una diagnosi clinica che è solo una diagnosi probabile e non definitiva84,85,86,87. Solo pochissimi studi mirati hanno confrontato i dati QEEG con il quadro neuropatologico per studiare la correlazione tra le varianti QEEG e LTS88,89e la distinzione tra FTLD e AD83. Terminando il nostro studio con una definizione della diagnosi neuropatologica, è quindi possibile interpretare correttamente le osservazioni fatte sull’attività elettrica cerebrale. Inoltre, eseguendo QEEG seriale in ogni soggetto possiamo tracciare la traiettoria delle onde EEG intra-individuali e le loro correlazioni con il quadro neuropatologico. A seguito di singole modifiche dell’attività elettrica corticale nel tempo può portare a una migliore comprensione del suo significato come biomarcatore per la demenza incipiente.
Applicazioni future e direzione del metodo
L’implementazione della distribuzione dei tessuti è uno dei nostri principali obiettivi potenziali. Per fare questo, abbiamo appena istituito una commissione scientifica che include il direttore della Fondazione GC (geriatra), un accademico di Neurologia dell’Università di Pavia, un neurologo e un patologo sia della Fondazione GC e dell’Ospedale Geriatrico ASP Golgi-Redaelli. Quando si distribuisce tessuto cerebrale, diapositive istologiche e altri campioni biologici, è importante ricordare che i donatori hanno accettato la donazione per il bene della ricerca. La distribuzione del materiale dovrebbe quindi avvenire con prudenza, proprio come descritto nel Codice di condotta BNE40. Qualsiasi parte che presenta una richiesta di materiale deve indicare il tipo e la quantità del campione necessario, fornire una descrizione del progetto di ricerca e come verranno utilizzati i campioni e, ove possibile, fornire prove di pubblicazioni precedenti (per il contratto di trasferimento, vedere la figura 9). La banca del cervello non funziona per il guadagno finanziario. Quindi, le tasse pagate dai ricercatori dovrebbero coprire solo le spese di approvvigionamento, lavorazione, stoccaggio e distribuzione dei tessuti.
Sono in moto piani per iniziare ad analizzare i casi con il sequenziamento dell’esoma e le tecniche Omics, come la proteomica e la trascrittiomica. La nostra metodologia di campionamento alternativo permetterà di eseguire studi sull’omica su tessuti istologicamente ben definiti di entrambi gli emisferi. Attraverso questo approccio, sarà possibile confrontare il modello di attivazione genica in diverse aree cerebrali dello stesso emisfero e nelle aree corrispondenti dell’altro emisfero, ed essere in grado di correlare l’attivazione genica con l’istopatologia. In questo campo, le applicazioni di deep learning sarebbero di grande interesse, tra cui l’analisi computerizzata delle diapositive istologiche e la correlazione all’avanguardia dei dati clinici, istologici e omici. Altre correlazioni tra molte variabili diverse possono essere identificate così come altre possibili applicazioni tecnologiche. La disponibilità di materiale congelato da entrambi gli emisferi consentirà una topografia accurata dell’attivazione genica e della distribuzione delle proteine. Questo sarà di particolare interesse anche in soggetti sani, considerando che entrambe le funzioni cerebrali e alcune malattie sono asimmetriche.
Inoltre, possiamo ottenere colture cellulari da donatori cerebrali ben caratterizzati. Infatti, le colture cellulari dei leptomeninges dei cervelli raccolti forniscono cellule viventi che possono essere utilizzate per ulteriori indagini di malattie o meccanismi di invecchiamento, attraverso la tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) che prevede la riprogrammazione dei fibroblasti leptomeningeali e la loro differenziazione in cellule neurali nei modelliavanzati 90.
Con l’età del cervello, possono verificarsi diversi profili di cambiamento a livello molecolare, cellulare e tissunte. Ogni cervello è unico. Ognuno ha il proprio modo di rispondere ai fattori di stress interni ed esterni; alcuni resiste, mentre altri soccombono e mostrano patologie distinte. Le discrepanze tra la presentazione clinica e il quadro neuropatologico spesso esistono perché la topografia delle lesioni, piuttosto che la loro natura molecolare, determina la presentazione clinica. La diagnosi corretta e definita potrebbe essere ottenuta solo combinando la sindrome clinica con i risultati neuropatologici che spesso aggiungono importanti indizi eziologici necessari per svelare la patogenesi delle malattie. In Europa, c’è uno sforzo per creare un approccio standard alla diagnosi neuropatologica. Il nostro protocollo diagnostico segue quasi completamente le linee guida recentemente pubblicate sulla diagnosi neuropatologica per il brain banking91. Questo ci permetterà di raccogliere e condividere tessuti cerebrali ben documentati, con l’obiettivo potenziale di istituire la prima Banca Italiana del Cervello. Infatti, in Italia ci sono depositi di cervello, ma non banche del cervello basate su studi di coorte. Il nostro obiettivo è quello di sviluppare un metodo per la raccolta del tessuto cerebrale che possa essere implementato in generale in tutta Italia, per creare una rete che utilizzi un protocollo comune e condivida materiale comparabile. A tal fine, il coinvolgimento di altri centri di ricerca e la creazione di un sito web specifico sono tra i principali obiettivi per il futuro.
Tecnologie innovative vengono costantemente utilizzate per l’analisi della natura molecolare delle malattie neurodegenerative e per l’identificazione dei biomarcatori. In questo contesto, ci sarà un crescente bisogno di cervelli accompagnati da informazioni sulle traiettorie cognitive e di invecchiamento ottenute attraverso studi longitudinali, sottolineando l’importanza di un approccio epidemiologico neuropatologicalmente verificato92.
The authors have nothing to disclose.
Vogliamo dedicare questo lavoro alla dott.ssa Michela Mangieri. Prima di morire prematuramente, concepì e iniziò il Progetto Abbiategrasso Brain Bank.
Siamo grati ai nostri donatori di cervelli, che stanno generosamente contribuendo alla ricerca donando l’organo più nobile del loro corpo; senza di loro questa ricerca non sarebbe possibile.
Siamo grati a Valeria Marzagalli per il suo prezioso lavoro nel progetto ABB.
Gli autori ringraziano il Professor Johannes Attems, il Dr. Paolo Fociani e il Dr. Giorgio Giaccone per la loro preziosa guida e saggio consiglio.
Ringraziamo la dott.ssa Alice Cirrincione e Miss Giulia Bortone per il loro prezioso aiuto in tutto il progetto.
Molte grazie alla signora Tere Cassani per il suo sostegno e a “Federazione Alzheimer Italia” per la sua collaborazione.
Gli autori sono grati al Dr. Matteo Moretti e al Prof. Antonio Marco Maria Osculati, Dipartimento di Salute Pubblica, Medicina Sperimentale e Forense dell’Università di Pavia.
50ml polypropilene conical tube 30x115mm | BD | 405253 | |
Anti-GFAP | Dako | Z0334 | policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000 |
Anti-NeuN (A60) | Chemicon | MAB377 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000 |
Anti-phospho TAU (AT8) | ThermoScientific | MN1020 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200 |
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2) | CosmoBio | TIP-PTD-P02 | policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 |
Anti-α-SYN (KM51) | Novocastra | NCL-L-ASYN | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min |
Anti-βamyloid (4G8) | BioLegend | 800703 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min |
Cutting board | BD | 352070 | |
DMEM High Glucose | Carlo Erba | FA30WL0101500 | medium |
Electrical saw with 5d blade | CEA | 06.06.14/06.00.16 | |
Electrode pH measure surface 12mm | CEA | 70064.250 HHH | |
Electrode pH needle | Fisher Scientific | 11796338 | |
EnVision+System-HRP | Dako | K4001 | secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2 |
EnVision+System-HRP | Dako | K4003 | secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2 |
Ethylether | SMI | 8401530 | |
Feather safety trimming knife blade 14cm | Fisher Scientific | 11749798 | |
Fetal Bovine Serum | Carlo Erba | FA30WS1810500 | medium supplement; dilution = 20% |
Forceps 15cm surgical or anatomical | Uvex | 500XG | |
Gloves | CEA | 01.28.14 | |
Glue | Arcobaleno | 2624000800002 | |
Head supporter | Lacor | 60456 | |
L-Glutamine (100X) | Carlo Erba | FA30WX0550100 | medium supplement; dilution = 1% |
Measuring tape | CEABIS | CEATA34 | |
Non adsorbable monofilament black polyamide | UHU Bostik | 8000053131470 | |
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140050 | medium supplement; dilution = 1% |
Pen/Strept Solution (100X) | Carlo Erba | FA30WL0022100 | medium supplement; dilution = 1% |
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm | CEA | 03.06.16 | |
Sterile scalpel with n°21 blade | |||
Surgical basin | Olcelli Farmaceutica | A930857255 | |
Surgical mallet and surgical cisel | CEA | 79.68.88 | |
Surgical scissor | CEA | 27.08.45/79.68.64 | |
Feather | M130RC |