פרוטוקול זה מתאר שיטה למעקב אחר מסלולים בודדים של הזדקנות המוח באמצעות תוכנית תרומת מוח ואפיון נכון של המוח. תורמי מוח מעורבים במחקר אורכי ארוך טווח כולל הערכות רב מימדיות סדרתיות. הפרוטוקול מכיל תיאור מפורט של עיבוד המוח ומתודולוגיית אבחון מדויקת.
באוכלוסייה מזדקנת כל הזמן, השכיחות של הפרעות ניווניות צפויה לעלות. הבנת מנגנוני המחלה היא המפתח לאמצעי מניעה וריפוי. הדרך היעילה ביותר להשיג זאת היא באמצעות בדיקה ישירה של רקמת מוח מחלה ובריאה. המחברים מציגים פרוטוקול כדי להשיג, לעבד, לאפיין ולאחסן רקמת מוח באיכות טובה שנתרמה על ידי אנשים הרשומים בתוכנית תרומת מוח לפני המוות. תוכנית התרומה כוללת גישה אמפתית פנים אל פנים לאנשים, אוסף של מידע קליני, ביולוגי, חברתי ואורח חיים משלים והערכות רב-ממדיות סדרתיות לאורך זמן כדי לעקוב אחר מסלולים אישיים של הזדקנות נורמלית וירידה קוגניטיבית. מכיוון שמחלות נוירולוגיות רבות הן אסימטריות, בנק המוח שלנו מציע פרוטוקול ייחודי לחיתוך דגימות טריות. מקטעים במוח של שתי ההמיספרות קפואים לסירוגין (ב-80 °C) או קבועים בפורמלין; פרוסה קבועה בחצי הכדור אחד מתאימה לחת קפואה בחצי הכדור השני. בגישה זו, אפיון היסטולוגי מלא של כל החומר הקפוא ניתן להשיג, מחקרים omics ניתן לבצע על רקמות היסטולוגיות מוגדר היטב משני ההמיספרות ובכך מציע הערכה מלאה יותר של מנגנוני מחלה ניוונית. אבחון נכון ומוחק של מחלות אלה ניתן להשיג רק על ידי שילוב התסמונת הקלינית עם הערכה נוירופתולוגית, אשר לעתים קרובות מוסיף רמזים אטיולוגיים חשובים הדרושים כדי לפרש את הפתוגנזה. שיטה זו יכולה להיות זמן רב, יקר ומוגבל כפי שהוא מכסה רק אזור גיאוגרפי מוגבל. ללא קשר למגבלותיו, מידת האפיון הגבוהה שהיא מספקת יכולה להיות מתגמלת. המטרה הסופית שלנו היא להקים את בנק המוח האיטלקי הראשון, כל זאת תוך הדגשת החשיבות של מחקרים אפידמיולוגיים מאומתים נוירופתולוגית.
לפי ארגון WHO, כ-50 מיליון בני אדם סובלים כיום מדמנציה, נתון הצפוי לשלש את עצמו עד 2050. מחלת אלצהיימר היא הגורם העיקרי של דמנציה, ואחריו מחלות כלי דם במוח והפרעות ניווניות אחרות הקשורות לגיל. בשנת 2017, WHO פיתח את מצפה הדמנציה העולמי כדי להעלות את המודעות לדמנציה ולעודד תוכנית פעולה גלובלית נגדו1. לכל אדם יש מסלול הזדקנות המוח שלו, ולכן החיפוש אחר התרופה יכול להיות מאתגר בשל המורכבות של פתוגנזה של מחלות ניווניות. אולי, כל אדם מחזיק בה או בפתוגנזה שלו כתובה ברקמת המוח הדורשת גישה מותאמת אישית. לכן, המחקר של רקמת המוח יהיה המפתח להבנת המנגנונים של ניוון עצבי.
במבט לאחור על ההיסטוריה של מדעי המוח, אנו מבינים כי התגליות המרשימות ופורות הדרך ביותר מעולם לא יכלו להתרחש ללא בדיקה ישירה של המוח האנושי. לאורך הזמן, המקור של רקמת המוח להיחקר השתנה מניתוחים גולמיים, אקראי ‘מפגשים מקריים’ ו, במקרים מסוימים, מסחר בלתי חוקי, לאוספים מוח מאורגן ובנקים מוח מודרניים אסטרטגיים. השיקול של היבטים אתיים רבים הוא אחד הגורמים העיקריים המבדילים בין בנקי מוח מודרניים לאוסף המוח של העבר. במחצית השנייה של המאה ה-20, במחצית השנייה של המאה ה-20, ה-Brain Banks (BBs) התהו במחצית השנייה שלהמאה ה-20. ניקולס קורסליס ווואלאס טורלוט יכולים להיחשב לחלוצים של בנקאות המוח המודרנית. בבריטניה, Corsellis אסף אוסף מחזיק מעל 1000 מוח מתועד היטב מושפע עם הפרעות נפשיות ונוירולוגיות שונות2. יתר על כן, Corsellis עזר לחשוף את הצורך לשמר רקמת מוח טרי בקרח למען בדיקות ביוכימיות3. בינתיים בארה”ב, וואלאס Tourtelotte הציג תוכניות תרומת מוח לפני המוות כדי להקל על שידול של תורמי מוח פוטנציאליים ולהבטיח כי המוח שנאסף מלווים בהיסטוריה רפואית ונוירולוגיתמלאה 4,5. לסקירה היסטורית של אוספי מוחות וBBs מודרני, ראה קרלוס ואח ‘. שש .
אז, למה אנחנו עדיין צריכים מוח אנושי? מחלות מוח יכולות להינתן רק אבחנה מוגדרת לאחר בדיקה נוירופתולוגית. נוירופתולוגיה מאתגרת את האבחנה הקלינית, והיא המפתח לפרשנות נכונה של התסמינים הקליניים ולגילוי הבסיסים ההיסטולוגיים של גרסאות סינדרום חדשות. אכן, ניתן להגדיר מחדש את האבחנה בהתבסס על התמונה הפתולוגית. עם זאת, שיעור הנתיחה שלאחר המוות ירד בעשורים האחרונים עקב הפיתוח האחרון של טכניקות הדמיה עצבית חדשניות. באמצעות הדמיה מוחית, השינויים מורפולוגיים, תפקודיים וחילוף חומרים במוח, כמו גם את היקף misfolding חלבון, ניתן להעריך vivo. עם זאת, בהדמיה עצבית vivo מחקרים אחרים סמן ביולוגי יכול רק לתת “הערכה” של התמונה הפתולוגית כפי שהם אינם מסוגלים לזהות שינויים תאיים ומולקולריים עדינים. התקדמות בהדמיה מולקולרית וגילוי סמנים ביולוגיים חדשים, מולקולותיעד, ועקבות 7 (למשל, עמילואיד, TAU, מעקבים microglial) להפוך את המוח האנושי אפילו יותר הכרחי לפרשנות של נתונים שהתקבלו הערכות קליניות ובדיקות סמן ביולוגי. יתר על כן, טכנולוגיות omics (גנומיקה, אפיגנומיקה, תעתיק, מטבולומיקה, פרוטאומיקה, ליפידומיקה, וכו’), שבוצע על רקמת מוח טרייה וקפוא, פתח אפשרויות חדשות להבנת מנגנוני המחלה וגילוי גנים בסיכון, סמנים אבחוניים ופרוגנוסטיים חדשניים, ותרופה פוטנציאליתיעדים 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,,21, 22,,23.,23
למטרות אלה, ארכיון BBs מודרני מאופיין היטב, רקמות מוח באיכות גבוהה מה שהופך אותם זמינים עבור הקהילההמדעית 3,24. המוח המסופק על ידי BBs צריך להיות מלווה בהיסטוריה קלינית מלאה. הפעילות של BB כוללת את הדברים הבאים: (1) הכרה וגיוס של אנשים חולים ובריאים לתוכניות לתרומת מוח; התנאי האידיאלי יהיה להשיג מעקב רב תחומי של תורמים לאורך כל החיים כדי להשיג פרופילים קליניים, סגנון חיים וחברתיים מלאים, ופרופילים של סמן ביולוגי; ואכן, העתודה הקוגניטיבית ומבנה המוח תלויים באורחהחיים ובגורמיםחברתיים-חינוכיים 25,26, כך שמידע זה מעשיר את הנתונים הכוללים בהישג יד. (2) רכישת המוח (המורכבת ממוחלת, מוח הקטן וגזע המוח) ורקמות קשורות (למשל, חוט השדרה, עצבי גולגולת וגנגליה וכו’) לאחר פטירתו של התורם, כל זאת תוך שמירה על תקנות משפטיות ואתיות מתוקנות. (3) עיבוד מתאים (ניתוח, קיבעון, הקפאה) של המוח, כמוגדר בפרוטוקול אופרטיבי מתוקננת, כדי להשיג רקמה באיכות גבוהה ולאפשר שימוש עתידי במחקר רב תחומי. (4) אפיון נוירופתולוגי מפורט המספק אבחנה סופית סופית. (5) אחסון והפצה של חומר רקמות לקהילהמחקרית 27,,28.
כל BBs לאחסן הן קפואפורמין קבוע פרפין מוטבע רקמות מוטבעות. לכל בי-בי יש פרוטוקול משלו. פרט למחקרים מסוימים, כגון פרוטוקול חיתוך דו-רפואי של מכון המחקר הביו-רפואי (ניוג’רזי) 29 והמחקר של דרמקורט על פתולוגיה מוחית30, ה-BBs הגדול ביותר בעולם פשוט לחתוך את המוח, המוח וגזע המוח לאורך קו האמצע (מישור קשת). חצי אחד נותח טרי ולאחר מכן קפוא ללימודים ביוכימיים, בעוד השני קבוע בפורמלין להערכה היסטופתולוגית. אז, ניתוחים ביוכימיים והיסטופתולוגיים מתבצעים בנפרד בכל חצי כדור. ההחלטה איזה צד קבוע או קפוא (רוח רוחב), תלויה בבנקיחיד 31,32,,33,34,35. כמו מחלות נוירולוגיות רבות הן אסימטריות, BB שלנו מציע פרוטוקול ייחודי לחיתוך מוח טרי: חלקים סמוכים של גזע המוח וכל חצי כדור הארץ קבועים וקפואים לסירוגין; פרוסה קבועה בחצי הכדור אחד מתאימה לחת קפואה בחצי הכדור השני. באמצעות שיטה זו, השימוש ברקמת המוח ממוטב, ואפיון היסטולוגי מלא של כל החומר הקפוא ניתן להשיג ולהשוות מידע היסטולוגי וביוכימי מכל האזורים של שתי ההמיספרות.
המסגרת של פרויקט בנק המוח שלנו היא העיר אביאטגראסו. אביאטגראסו (במילאנו: Abbiategrasso) היא עיירה קטנה כ-22 ק”מ דרומית-מערבית לעיר מילאנו שבצפון איטליה. אוכלוסייתה מונה כ-32,600 איש. זהו ביתה של קרן גולגי-צ’נסי (GC). קרן GC היא חלק מבית חולים גריאטרי שיקום גדול (ASP Golgi-Redaelli), והוא מכון המתמקד במחקר על הזדקנות וטיפול בקשישים. במיוחד, היא מתמקדת בלימוד הזדקנות נפשית, הגורמים החברתיים וההתנהגותיים המשפיעים עליו, ואת הביולוגיה והפתולוגיה הבסיסית הפרעות נוירוקוגניטיביות תלויות גיל (NCDs). בשנת 2009 השיקה קרן GC מחקר אורכי חדש עם 1321 משתתפים (מתוך 1644 נושאים זכאים: שיעור תגובה ראשוני של 80.3%) נולד בין 1935 ל-1939 (בגיל 70-75), ממוצא אתני קווקזי, חי באותו אזור גיאוגרפי קטן. המחקר נקרא InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; באנגלית: המוח הזדקנות Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) והוא כיום מתמשך. InveCe.Ab מתוכננת להשיג קוהורטה עם הומוגניות מקסימלית ופחות שונות על מנת להעריך את השכיחות, השכיחות וההיסטוריה הטבעית של דמנציה, יחד עם גורמי הסיכון או ההגנה האפשריים שלה, כולל משתנים התנהגותיים, פסיכו-חברתיים, קלינייםוביולוגיים 36. מאפייני הקוהורטה מוצגים בא איור 1 ובטבלה 1. הנתונים האפידמיולוגיים עולים בקנה אחד עם מגמתדמנציה באוכלוסייה האירופית 37,38 ו משתתפים InveCe.Ab יש מאפיינים גנטיים וסביבתיים הומוגניים, המייצג מודל טוב ללמוד את המסלול מהזדקנות רגילה להפרעות נוירוקוגניטיביות. ואכן, אוכלוסיות הומוגניות דורשות פחות נושאים כדי להגיע לכוח סטטיסטי הולם. המתודולוגיה InveCe.Ab כברדווחה במקום אחר 36 אבל חשוב להדגיש את הגישה הרב מימדית שלה באמצעות בדיקות תקופתיות (כל 2-3 שנים) באמצעות אותה קבוצה של הערכות כולל: דגימת דם (פאנל חילוף חומרים, הומוציסטאין וויטמינים, מיצוי DNA לפרופיל Apolipoprotein E (APOE) ופולימורפיזם גנטי אחר הקשורים קוגניציה והזדקנות), מדידות אנתרופומטריות (משקל, גובה ומותן), מדבר תוך כדי הליכה מבחן (מבחן משימה כפולה), ראיון כדי להמחיש את אורח החיים (דבקות דיאטה ים תיכונית, רמות של פעילות גופנית ומעורבות קוגניטיבית) גורמים חברתיים (מעורבות חברתית, בדידות), הערכה נוירופסיכולוגית ובדיקה כללית קלינית. כדי להשוות נתונים אורכיים כאלה עם נתונים נוירופתולוגיים שלאחר המוות יהיה קריטי למחקר. לכן, הצוות שלנו ובמיוחד ד”ר מיקלה מנגירי הגה את הגישה הנוירופתולוגית שהוזכרה לעיל. מאז 2014 ובמהלך המעקב השני, התבקשו משתתפי InveCe.Ab לתרום את מוחם, ובכך להביא ללידתו של בנק המוח Abbiategrasso (ABB). התורמים העיקריים של ABB הם המשתתפים InveCe.Ab אבל ABB פתוח כעת לתורמים מתנדבים אחרים. הם חולים מ ASP Golgi-Redaelli, ביתם של מספר חולים נגועים במחלות נוירולוגיות שונות או מתנדבים מבוגרים שלומדים על פרויקט ABB ומשתייכים לאותו אזור גיאוגרפי (Abbiategrasso וסביבתה). כל התורמים עוברים את אותו פרוטוקול הערכה.
המחברים מציעים שיטה למעקב אחר מסלולים בודדים של הזדקנות רגילה והתקדמות אפשרית לNCDs, ולנהל במדויק, לעבד ולאפיין את המוח שנרכש מתורמים כאלה בעקבות אורכי. יתר על כן, המטרה שלנו היא לפגוש ולהעסיק אנשים בהערכות נוירולוגיות תקופתיות, סמינרים ופעילויות חינוכיות לגבי שלוחו של המוח ולהעלות את המודעות שלהם לתרומת מוח למטרות מחקר.
שלבים קריטיים בפרוטוקול
המטרה שלנו היא להשיג, לאפיין ולאחסן רקמות באיכות טובה המגיעות מנושאים עם היסטוריה מפורטת הנגזרת מתצפית אורכית. כדי להגיע למטרה זו, הוא נדרש להתמודד עם ההיבטים המרכזיים הבאים. כמתואר לעיל, הפרוטוקול מתחיל בגיוס תורמים, שהוא הצעד המכריע הראשון. לאחר מכן, יש צורך שהתורמים ימשיכו בתוכנית המעקב וישמרו על ההדבקה בפרויקט לאורך זמן עד לתרומה בפועל של המוח. בזמן המוות, יש צורך צוות ABB לקבל הודעה מיד על מנת לכנס את צוות הנתיחה בתוך 24 שעות, להיות חשוב לאיכות רקמות נאותה. חיתוך טרי של האונה המוחית דורש יד יציבה ואימונים ספציפיים. כדי למנוע נזק תאי שנגרם על ידי הקפאה איטית ולקבל פרוסות באיכות טובה עבור cryostat ו Omics, חשוב כי הם קפואים במהירות. בהתחשב במהירות החדירה של תמיסת פורמלין (1 מ”מ/שעה), כדי לשמר את אנטי-גניות הרקמות, זמן ההשריה של הפרוסה הבודדת נשמר לכל הפחות.
פתרון בעיות של השיטה
על מנת לטפל בצעדים הקריטיים שהוזכרו לעיל אנו מציעים את הגישה הבאה. גיוס תורמים ודבקות במעקבים: ישנם מספר גורמים המעכבים את תרומת המוח, לרבות פחדים לפגיעה בנתון הגוף, בטוהר ובשלמות, או לאפשרות של תחושת כאב לאחר המוות. חלקם אף חוששים כי הנתיחה עשויה לערך בעודם בחיים70,71. כמו כן, קיים חשש לשיבוש הסדרי הלוויה והנטלהכלכלי. יתר על כן, חוסר הידע של צוות רפואי על הליכים שלאחר המוות וחוסר היכולת לטפל בחששות של תורמים פוטנציאליים או NOK שלהם עשוי להרתיע רישום. כל הגורמים הללו עשויים לייצר רמה נמוכה של מודעות עם מספר נמוך של משתתפים רשומים ואפשרות גבוהה של אובדן תורם לאורך זמן. ואכן, תוכנית גיוס התורמים צריכה להיות יעילה בהפצת מודעות, בהחדיר אמון ולשכנע אנשים להירשם ולשמור על שיעורים גבוהים של השתתפות במעקב. מניסיוני, הדבר נעשה באמצעות בחירה קפדנית של תורמים פוטנציאליים והסבר מעמיק על מטרות ה-BB. אנו מציעים פעילויות חינוכיות וגישה אמפתית הנותן מענה לפחדים ולצרכים של אנשים בריאים והן של אלה המושפעים ממחלות ניווניות ומשפחותיהם. אנו מוצאים כי תורמים פוטנציאליים נוטים יותר לתת את הסכמתם כאשר ניגשים באופן אישי. גישה פנים אל פנים יוצרת מערכת יחסים המבוססת על אמון וכבוד הדדיים, שהיא בסיסית להשגת אחוז גבוה של רישום לתרומת מוח והערכות מעקב. צוות מיומן מאוד עם תחושה חזקה של אתיקה ניגש תחילה לתורם הפוטנציאלי, דן באפשרות של תרומת המוח לאחר המוות, מסביר את הערך של רקמת המוח האנושית למחקר מדעי עצבי, ומבהיר כל ספק לגבי הליכים שלאחר המוות. מפה לאוזן חיובית חשובה לא פחות. לאחר קצירת המוח, תשומת לב וטיפול מתאימים ניתנת כדי לחשב מחדש את גוויית. חשוב מתוך כבוד והכרת תודה לאדם המנוח על ידי טיפול בגוויה בעדינות. כמה חודשים לאחר מכן, פגישה מתוכננת להעביר את התוצאות של הניתוח הנוירופתולוגי בכל פעם שביקשו בני משפחה.
זמן המוות וקצירת המוח: כאשר האדם מקבל, הוא הופך לתורם ומקבלים תעודת זהות עם מספר ליצירת קשר 24 שעות ביממה, 7 ימים בשבוע (מספר הקבלה של ASP Golgi-Redaelli בית החולים הגריאטרי המחובר אלינו). כמו-כן, ניתן תג דבק לקרובי המשפחה לשימוש במקרה של אשפוז. סוכנויות ההלוויה של האזור עודכנו בעבר להביא את הגופה למתקנים ABB, שם צוות הנתיחה זומן. צוות הנתיחה מורכב מפתולוג, נוירולוג ו/או נוירוביולוג, וטכנאי חדר אנטומי, שנמצאים בקריאה בין השעות 06:00-23:00 מדי יום; חלק מהסטודנטים החניכים נוכחים לעתים קרובות כדי לסייע ולצלם.
הדיוק והעקביות של הליכי החיתוך הטריים מובטחים על ידי מעורבותם של אותם שני מפעילים (נוירולוג ופתולוג) שפיתחו את השיטה ויש להם מספר שנות ניסיון בנוירופתולוגיה. כאשר מקפיאים את הפרוסות, הם מניחים על מגש אלומיניום קפוא ומכסים בצלחת אלומיניום שלובת כדי לשמור אותם שטוחים היטב. מיד לאחר מכן, הם מכניסים חנקן נוזלי במשך 3 דקות, לפני אחסון אותם ב -80 מעלות צלזיוס. הפרוסות לתיקון עטופות בנפרד בגזה, וספוגות בתמיסת פורמלין עם 10% פוספט, אשר מוחלפת לאחר יום אחד. לאחר מכן, הם נשמרים בפורמל לא יותר מ 5 ימים נוספים; עם זאת, בהתחשב בכך שהפתרון פורמלין חודר ב-1 מ”מ/יום, ברצוננו לקצר עוד יותר את זמן ההשריה.
מגבלות השיטה
שיטת המחקר המתוארת כאן מכסה רק אזור גיאוגרפי מוגבל, ולאנשים המעורבים בתוכנית התרומה יש מאפיינים שלא לגמרי מייצגים את האוכלוסייה הכללית. למרות יותר מקובל, מרווח לאחר המוות עד 24 שעות עשוי לייצר שינויים במבנים מסוימים של חלבון, אנזימים ו RNA של רקמת המוח. הקביעה של AFS ו- pH לא יכול להיות לגמרי מתאים לקביעתאיכות רקמות 73 ואנחנו מפתחים דרכים אחרות של אימות איכות רקמות בהתבסס על תקינות RNA.
לגבי הליך חיתוך microtome, למרות שימושי מאוד לשחזור יחסים אנטומיים, יש ל ציין כי השימוש macrosections אינו פשוט ומציג כמה קשיים טכניים. השיטה שלנו מאתגרת וגוזלת זמן. העלויות גבוהות למדי והמימון לא תמיד קל. המימון מגיע בעיקר מהציבור (ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital) ומהמשאבים הפרטיים (קרן גולגי-צ’נסי), תרומות פרטיות, ארגונים ללא כוונת רווח (למשל “Federazione Alzheimer Italia”) ומעניק השתתפות.
משמעות שיטת ABB ביחס לשיטות קיימות/חלופיות
בהתחלה, תוכנית תרומת המוח שלנו התמקדה באנשים המשתתפים במחקר האורך של InveCe.Ab. כתוצאה מכך, המוחות שנתרמו מלווים במידע קליני, ביולוגי וחברתי מפורט שנאסף לאורך השנים. כוחו של ABB נובע בדיוק ממוצא ייחודי זה. ואכן, לימוד קבוצה של אנשים בעלי קשרים חברתיים וגנטיים המחלוקים מאפיינים ביולוגיים וחשיפות סביבתיות משפר את הניתוח הסטטיסטי. יתר על כן, המחקר כולל את היתרונות הבאים: 1) טיפול ומתן לצרכי הקהילה (מעשה של “נתינה לפני ששואל”): אנשים מקבלים בדיקה תקופתית חינם שבה המטפל הכללי מיודע, מספר טלפון של המזכיר שלנו מסופק לייעוץ, ואנשים עם מוגבלויות קשות מבקרים בבית; 2) מעורבות משתתפים, אנשים בעלי תפקידים ציבוריים ומתרגלים כלליים בפעילויות חינוכיות באמצעות ארגון סמינרים תקופתיים (הקשורים לבריאות המוח, תרומת מוח ובריאות כללית), ותכנון קורסים נושאיים (למשל שימוש במכשירי טכנולוגיית מידע לקשישים); 3) לפגוש אנשים ולאמץ גישה פנים אל פנים. כל האלמנטים הללו מהווים את כוחו של פרויקט ABB. יתר על כן, הפרויקט משפר את היכולות הקליניות של צוותים רפואיים מעורבים, כפי שהם צוברים ניסיון הן הערכות לפני המוות והן הערכות נוירופתולוגיות שלאחר המוות. בהקשר זה, ברצוננו להזכיר את החוויה המוזרה מאוד של “מחקר הזדקנות המיעוט”. מחקר זה כלל מספר מוגבל ונבחר של אפרו-אמריקאים המגורים באזור שיקגו (784 מתוך 1,357 נושאים זכאים: שיעור תגובה של 57%). המשתתפים ביקרו מדי שנה בבית והתבקשו להצטרף לתוכנית לתרומת המוח. מחקר זה מבוסס על גישה יוצאת דופן עם כמה קווי דמיון ל שלנו קבלת אחוזים גבוהים של תגובה חיובית לתוכנית תרומת המוח (352 תורמים מתוך 784 משתתפים נרשמו: 44%), אם כי שיעור הנתיחה שלאחר המוות לא היה ממש משביע רצון(53%) 74. בדיוק כמו ב”מחקר הזדקנות המיעוט”, אנו מציעים פעילויות חינוכיות וגישה אמפתית, ומשיגים תוצאות מצוינות. בפרט, שיעור התגובה שלנו הוא 93%, אחוז ההרשמה הוא 28.7%, ואחוז הנתיחה שלאחר המוות כרגע הוא 67%. שיעורים אלה מראים כי פרויקטים העוסקים ישירות אנשים יש אחוז משמעותי יותר של תרומות. תוכניות אחרות לתרומת מוח, עם פחות תשומת לב לבניית מערכת יחסים עם תורמים פוטנציאליים, בדרך כלל יש אחוזי הרשמה נמוכים, להיות סביב 10-15% אופחות 73,75.
יש מעט מחקרים קודמים של החבורה שמסתיימים בניתוח נוירופתולוגי. יתר על כן, רוב הבנקים במוח ומאגרים הם ממורכזים במחלות ויש מחסור במוח “שליטה” מתורמים בריאים בהשוואה למספר המוחות “11”. רק מספר מוגבל של BBs מבוססים על מחקרי אוכלוסייה מעורבים הן נושאים מחלה ונורמלי על מנת ללמודמסלולי הזדקנות 73,74,76,77,78,79,80. כמה מחקרים כגון “מחקר הזדקנות המיעוט”בארה”ב 74 ו “Vantaa 85+ המחקר”בפינלנד 76 דומים ל שלנו אבל הם נוטים לרוץ החוצה עם סיום של cohort. במקום זאת, תוכנית התרומה של ABB צפויה להימשך זמן רב בעתיד, גיוס תורמים פוטנציאליים ותזמון מעקבים גם לאחר סיום המחקר האורך InveCe.Ab. גישה זו הופכת את שיטת הגיוס שלנו לדומה לזו של תוכנית תרומת המוח של המכון לבריאות השמש (SHRI) המיועדת לקהילהגמלאית 73. פרוטוקול SHRI לתרומת מוח יעיל מאוד עם מרווח הזמן הקצר ביותר בעולם לאחר המוות (3.92 שעות). בדומה BBs הגדול ביותר בעולם, פרוטוקול SHRI פשוט לחתוך את המוח, המוח הקטן וגזע המוח בקו האמצע (מישור sagittal), אז חצי אחד הוא חתוך טרי וקפוא ללימודים ביוכימיים, בעוד השני קבוע פורמלין להערכה היסטופתולוגית. עם זאת, אחת החוזקות של פרוטוקול כריתת SHRI היא קיבעון של פרוסות בודדות במקום חצי הכדור כולו. אכן, קיבעון חצי הכדור כולו אינו אופטימלי, בשל מעברי קיבעון שונים בין פני השטח לליבה. יתר על כן, החלבונים הקליפתיים עשויים להיות מושפעים מחשיפה ממושכת לפתרון הפורמטין. לכן, הסיבה שהחלטנו לתקן פרוסות בודדות.
ההחלטה לגבי איזה צד קבוע או קפוא, תלויה בבנק יחיד (תמיד זהה, מוקצה באופן אקראי או מוקצה תלוי אם יום הפירוק הוא מוזר אואפילו) 31,32,33,34,35. אז, ניתוח ביוכימי והיסטופתולוגי מתבצעים בנפרד בכל חצי כדור. כמו מחלות נוירולוגיות רבות הן אסימטריות, BB שלנו מציע פרוטוקול ייחודי לחיתוך דגימות טריות: קטעים חלופיים מגזע המוח ומכל חצי הכדור של המוח הקטן והמוח נשמרים כחומר קבוע או קפוא; פרוסה קבועה בחצי הכדור אחד מתאימה לחת קפואה בחצי הכדור השני. השיטה שלנו נותנת הזדמנות להשיג אפיון היסטולוגי מלא של כל החומר הקפוא ולהשוות את התוצאות מכל התחומים של שני הצדדים. כפי נאמר בהקדמה, השיטה המתוארת מאפשרת לנו להשיג מידע רב ככל האפשר מרקמות המוח. יתר על כן, השיטה של ABB מניבה אפיון נוירופתולוגי בסיסי אך מלא, כולל כמעט כל חלבוני המוח הידועים ופתולוגיה של כלי דם. בשל התפקיד השנוי במחלוקת של פציעות כלי דם בקביעת פגיעה קוגניטיבית, החלטנו להשתמש ניקוד כפול עבור נטל כליהדם 30,53.
כפי שהוסבר בפרוטוקול, אנו משתמשים בגישה רב תחומית. למרות שזו שיטה גוזלת זמן ומיוכלת, אנו מאמינים שהיא מספקת מספר יתרונות למחקר. לדוגמה, בעבודה קודמת, הוכחנו כי tHcy גבוה בפניעצמו, או MTHFR C677T TT המשויך אלל APOE-ε4, עשוי להיות קשור לתפקוד לקוי של ההנהלה ולא אובדן זיכרון81. לכן, זה עשוי להיות מעניין להעריך נושאים עם פרופיל גנטי מסוים זה ברמה נוירופתולוגית. זוהי דוגמה לאופן שבו מעקב מעמיק כזה שימושי ביצירת השערות מחקר חדשות הניתנות לאימות באמצעות חקירה של חומר ביולוגי שנאסף בבנק שלנו. הדגמה נוספת של היתרון של הגישה שלנו היא הכללת QEEG בין ההערכות שאנו מבצעים באופן שגרתי, על מקוריותו ואת קלות השימוש היחסית. אכן, EEG מזהה את הפעילות הסינפטית של קליפת המוח על ידי הקלטת הפוטנציאל החשמלי של דנדריטים השייכים נוירונים פירמידהקליפתית 82. QEEG יכול להיחשב סמן ביולוגי להערכת פעילות סינפטית קליפתית אשר קשורה קוגניציה83. במיוחד, ירידה במקצבים אלפא בחלק האחורי של המוח עם עלייה כללית של תדרים נמוכים יותר (תטא ומקצבים דלתא) היה קשור להתמוטטות חיבור קליפתי. יש לקחת בחשבון כי רוב מחקרי מתאם אבחון התבססו על אבחנה קלינית כי הוא רק סביר ולא אבחנהמוגדרת 84,85,86,87. רק מעט מאוד מחקרים ממוקדים השוו את נתוני QEEG עם התמונה הנוירופתולוגית כדי לחקור את הקשר בין QEEG ו- LTSגרסאות 88,89, ואת ההבחנה בין FTLD ו-AD 83. על ידי סיום המחקר שלנו עם הגדרה של האבחנה הנוירופתולוגית, לאחר מכן ניתן לפרש כראוי את התצפיות שנעשו על פעילות חשמלית מוחית. יתר על כן, ביצוע QEEG סדרתי בכל נושא אנחנו יכולים לעקוב אחר מסלול גלי EEG פנים בודדים ואת המתאם שלהם עם התמונה הנוירופתולוגית. בעקבות שינויים בודדים של פעילות חשמלית קליפתית לאורך זמן יכול להוביל להבנה טובה יותר של משמעותה כסמן ביולוגי לדמנציה מוקדם.
יישומים וכיוון עתידיים של השיטה
יישום חלוקת הרקמות היא אחת המטרות הפוטנציאליות העיקריות שלנו. על מנת לעשות זאת, הקמנו רק ועדה מדעית כולל מנהל קרן GC (גריאטרי), אקדמי של נוירולוגיה מאוניברסיטת פאביה, נוירולוג ופתולוג הן מקרן GC & בית החולים הגריאטרי ASP Golgi-Redaelli. בעת הפצת רקמת מוח, שקופיות היסטולוגיות ודגימות ביולוגיות אחרות, חשוב לזכור כי התורמים הסכימו לתרומה לצורך המחקר. לפיכך, התפלגות החומר צריכה להתקיימה בזהירות, כפי שמתואר בקוד ההתנהגות BNE40. כל צד השולח בקשה לחומר צריך לציין את סוג וכמות המדגם הדרושים, לספק תיאור של פרוייקט המחקר וכיצד ייועדו בדגימות, ובמידת האפשר, לספק ראיות לפרסומים קודמים (עבור הסכם ההעברה, ראה איור 9). בנק המוח לא עובד לרווח כספי. לכן, העמלות ששולמו על ידי החוקרים צריכות לכסות רק את ההוצאות של רכישת רקמות, עיבוד, אחסון והפצה.
תוכניות להתחיל לנתח מקרים עם רצף exome וטכניקות Omics, כגון פרוטאומיקה ותעתיק, נמצאים בתנועה. מתודולוגיית הדגימה החלופית שלנו תאפשר לבצע מחקרי אומיקה על רקמות היסטולוגיות מוגדרות היטב משתי ההמיספרות. באמצעות גישה זו, ניתן יהיה להשוות את התבנית של הפעלת גנים באזורים שונים במוח של אותו חצי הכדור באזורים המתאימים של חצי הכדור השני, ולהיות מסוגל לתאם את הפעלת גנים עם היסטופתולוגיה. בתחום זה, יישומי למידה עמוקה יהיו בעלי עניין רב, כולל ניתוח ממוחשב של שקופיות היסטולוגיות ומתואמת חדשנית של נתונים קליניים, היסטולוגיים ואומיקה. ניתן לזהות מתאם אחר בין משתנים רבים ושונים, כמו גם יישומים טכנולוגיים אפשריים אחרים. הזמינות של חומר קפוא משתי ההמיספרות תאפשר טופוגרפיה מדויקת של הפעלת גנים והפצת חלבונים. זה יהיה עניין מיוחד גם בנושאים בריאים, בהתחשב בכך שגם תפקודי המוח וגם כמה מחלות הן אסימטריות.
יתר על כן, אנחנו יכולים להשיג תרביות תאים מתורמים מוח מאופיין היטב. אכן, תרביות תאים מן leptomeninges של המוח שנקטפו לספק תאים חיים שניתן להשתמש בהם לחקירה נוספת של מחלות או מנגנוני הזדקנות, באמצעות טכנולוגיית תאי גזע pluripotent המושרה (iPSCs) אשר כרוך בתכנות מחדש של פיברובלסטים לפטומינינגיל ולהבדיל אותם לתאים עצביים במודליםמתקדמים 90.
ככל שהמוח מזדקן, פרופילים שונים של שינוי יכולים להתרחש ברמה המולקולרית, התאית והרקמות. כל מוח הוא ייחודי. לכל אחד יש דרך משלו להגיב ללחצים פנימיים וחיצוניים; חלקם מתנגדים בעוד אחרים נכנעים והצגת פתולוגיות נפרדות. פערים בין המצגת הקלינית לתמונה הנוירופתולוגית קיימים לעתים קרובות משום שהטופוגרפיה של הנגעים, ולא האופי המולקולרי שלהם, קובעת את המצגת הקלינית. האבחנה הנכונה והמוחדה יכולה להיות מושגת רק על ידי שילוב התסמונת הקלינית עם הממצאים הנוירופתולוגיים אשר לעתים קרובות להוסיף רמזים אטיולוגיים חשובים הדרושים כדי לפענח את הפתוגנזה של המחלות. באירופה, יש מאמץ ליצור גישה סטנדרטית לאבחון נוירופתולוגי. פרוטוקול האבחון שלנו כמעט לחלוטין עוקב אחר ההנחיות שפורסמו לאחרונה על אבחון נוירופתולוגי עבור בנקאותמוחית 91. זה יאפשר לנו לאסוף ולשתף רקמת מוח מתועדת היטב, במטרה פוטנציאלית להקים את בנק המוח האיטלקי הראשון. אכן, באיטליה יש מאגרי מוח אבל לא בנקי מוח המבוססים על מחקרי קוהורטה. המטרה שלנו היא לפתח שיטה לקצירת רקמת מוח שניתן ליישם באופן נרחב ברחבי איטליה, כדי להקים רשת המשתמשת בפרוטוקול משותף וחולקת חומר דומה. על מנת לעשות זאת, המעורבות של מרכזי מחקר אחרים ויצירת אתר ספציפי הם בין המטרות העיקריות לעתיד.
טכנולוגיות חדשניות משמשות כל הזמן לניתוח של האופי המולקולרי של מחלות ניווניות ולזיהוי סמן ביולוגי. בהקשר זה, יהיה צורך גובר במוח מלווה במידע על מסלולים קוגניטיביים והזדקנות שהושגו באמצעות מחקרים אורכיים, תוך שימת דגש על החשיבות של גישה אפידמיולוגית מאומתתנוירופתולוגית 92.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להקדיש את העבודה הזו לד”ר ש”ס מישלה מנגירי. לפני שהיא מתה בטרם עת, היא הרתה והתחילה את פרויקט בנק המוח Abbiategrasso.
אנו אסירי תודה לתורמי המוח שלנו, אשר תורמים בנדיבות למחקר התורמים את האיבר האצילי ביותר בגופם; בלעדיהם מחקר זה לא היה אפשרי.
אנו אסירי תודה לוואלריה מרזאגלי על עבודתה היקרה בפרויקט ABB.
המחברים מודים לפרופ’ יוהנס אטמס, ד”ר פאולו פוצ’יאני וד”ר ג’ורג’יו ג’יקון על הדרכתם היקרה ועל ייעוץ חכם.
ברצוננו להודות לד”ר אסא אליס סירינצ’יונה ולמיס ג’וליה בורטונה על עזרתם היקרה לאורך כל הפרויקט.
תודה רבה לגב’ טרה קסאני על תמיכתה ועל “פדציונה אלצהיימר איטליה” על שיתוף הפעולה שלה.
המחברים אסירי תודה לד”ר מתיאו מורטי ופרופ’ אנטוניו מרקו מריה אוסקולטי, המחלקה לבריאות הציבור, רפואה ניסיונית וזיהוי פלילי, אוניברסיטת פאביה.
50ml polypropilene conical tube 30x115mm | BD | 405253 | |
Anti-GFAP | Dako | Z0334 | policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000 |
Anti-NeuN (A60) | Chemicon | MAB377 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000 |
Anti-phospho TAU (AT8) | ThermoScientific | MN1020 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200 |
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2) | CosmoBio | TIP-PTD-P02 | policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 |
Anti-α-SYN (KM51) | Novocastra | NCL-L-ASYN | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min |
Anti-βamyloid (4G8) | BioLegend | 800703 | monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min |
Cutting board | BD | 352070 | |
DMEM High Glucose | Carlo Erba | FA30WL0101500 | medium |
Electrical saw with 5d blade | CEA | 06.06.14/06.00.16 | |
Electrode pH measure surface 12mm | CEA | 70064.250 HHH | |
Electrode pH needle | Fisher Scientific | 11796338 | |
EnVision+System-HRP | Dako | K4001 | secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2 |
EnVision+System-HRP | Dako | K4003 | secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2 |
Ethylether | SMI | 8401530 | |
Feather safety trimming knife blade 14cm | Fisher Scientific | 11749798 | |
Fetal Bovine Serum | Carlo Erba | FA30WS1810500 | medium supplement; dilution = 20% |
Forceps 15cm surgical or anatomical | Uvex | 500XG | |
Gloves | CEA | 01.28.14 | |
Glue | Arcobaleno | 2624000800002 | |
Head supporter | Lacor | 60456 | |
L-Glutamine (100X) | Carlo Erba | FA30WX0550100 | medium supplement; dilution = 1% |
Measuring tape | CEABIS | CEATA34 | |
Non adsorbable monofilament black polyamide | UHU Bostik | 8000053131470 | |
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140050 | medium supplement; dilution = 1% |
Pen/Strept Solution (100X) | Carlo Erba | FA30WL0022100 | medium supplement; dilution = 1% |
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm | CEA | 03.06.16 | |
Sterile scalpel with n°21 blade | |||
Surgical basin | Olcelli Farmaceutica | A930857255 | |
Surgical mallet and surgical cisel | CEA | 79.68.88 | |
Surgical scissor | CEA | 27.08.45/79.68.64 | |
Feather | M130RC |