다운스트림 분석을 위한 냉동 설치류 뇌 영역 모음
Summary
이 절차는 저렴하고 일반적으로 사용할 수있는 도구를 사용하여 고품질의 단백질과 RNA를 얻기 위해 이산 냉동 뇌 영역의 수집을 설명합니다.
Abstract
신경생물학에 대한 우리의 이해가 진행됨에 따라, 분자 분석은 종종 내측 전두엽 피질 (mPFC) 또는 핵 accumbens와 같은 작은 두뇌 지역에 실행됩니다. 이 작업의 과제는 검사할 미세 환경을 유지하면서 올바른 영역을 해부하는 것입니다. 이 백서에서는 대부분의 랩에서 쉽게 사용할 수 있는 리소스를 사용하는 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. 이 방법은 과정을 통해 동결 조직을 유지하여 핵산과 단백질을 보존합니다. 뇌는 뇌 매트릭스를 사용하여 0.5-1.0 mm 섹션으로 절단되고 냉동 유리 판에 배열됩니다. 각 섹션 내의 랜드마크는 알렌 마우스 브레인 아틀라스와 같은 참조와 비교되며, 지역은 차가운 메스 또는 생검 펀치를 사용하여 해부됩니다. 그런 다음 조직을 사용할 때까지 -80°C에서 보관합니다. 이 과정을 통해 쥐 및 마우스 mPFC, 핵 accumbens, 등쪽 및 복부 해마 및 그밖 지구는 qRT-PCR 및 서양 분석학을 사용하여 성공적으로 분석되었습니다. 이 방법은 명확한 랜드 마크에 의해 식별 될 수있는 뇌 영역으로 제한됩니다.
Introduction
이 연구는 알렌 마우스 브레인 아틀라스1과같은 참조를 사용하여 고품질의 핵산 또는 단백질을 추출하기 위한 냉동 뇌 영역의 해부를 가이드로 보여줍니다. 이 기술에서, 뇌는 플래시 냉동 및 동결 된 상태에서 유지되는 동안 나중에 단면및 해부를 위해 -80 °C에서 저장됩니다. 이 과정을 통해 연구원은 한 세션에서 많은 수의 뇌를 수확하고 나중에 여러 뇌 영역의 정확한 수집을 위해 해부 할 수 있습니다.
유전자 및 단백질 발현과 관련된 질문에 답할 때 관심 있는 뇌 영역(ROI)의 정확한 수집이 종종 필요합니다. 약리학, 전기 생리학 및 광유전학은 관찰된 행동2,,3,,4를뒷받침하는 분자 변화를 해명하는 것을 돕기 위하여 야생형 또는 유전자 변형 설치류에 사용될 수 있는 동안, 전사체 및 단백질에 있는 유도한 변경의 측정은 수시로 이 사실 인정을 지원하기 위하여 이용됩니다. 정량적 역전사 중합체 연쇄 반응(RT-qPCR), 서부 블로팅, RNAseq5,MAPSeq6 및 HPLC7과 같은 기술은 견고하고 상대적으로 비용이 저렴하여 많은 실험실이 작은 뇌 영역2,,4,,5,,6내에서 유도된 분자 변화를 연구할 수 있도록 합니다.
뇌 영역에서 핵산 또는 단백질을 추출하고 정제하는 방법에는 여러 가지가 있다8,,9,10,,911,,12. 많은 실험실은 수확9,,13의시간에 얼음에 뇌를 냉각하고 절단하여 뇌 영역을 수확 . 이러한 접근법은 고품질 의 핵산 및 단백질을 초래할 수 있지만, 조직의 미세 환경 내의 분해가 이들 온도에서 일어날 수 있기 때문에 다소 시간 제한적이다. 이것은 한 자리에 많은 수의 동물 이나 ROI를 해부 하려고 할 때 특히 사실 일 수 있습니다. 샘플을 동결상태로 유지하는 것은 비교적 순수한 샘플을 수집하기 위한 노력의 일환으로 각 섹션의 양쪽에 있는 랜드마크를 신중하게 비교할 수 있는 연구자의 시간을 제공하면서 비순한 표적 분자를 유지하는 데 도움이 됩니다. 레이저 포획은 뇌 영역에서 RNA 또는 단백질 분석을 위한 조직을 수집하는 또 다른 방법10. 이 절차는 매우 작고 불규칙한 모양의 ROI가 식별되고 분리될 수 있다는 점에서 기계적 해부보다 우수하다. 그러나, 레이저 포획은 고가의 장비 및 시약의 사용에 의해 제한되며, 시간이 많이 소요되며 또한 시료 열화에 더 취약할 수 있다.
냉동 된 조직에 마이크로 펀치 해부는 새로운 것이 아닙니다. 미클로스 팔코비트와 다른 사람에 의해 초기 논문은 세부사항 14,,15의기본 기술을 설명합니다 . 이 프레젠테이션은 주로 효율성을 용이하게하고 필요한 장비의 비용을 줄이기 위해 몇 가지 개선과 함께, 원래의 작업을 다음과 같습니다. 예를 들어, 뇌 섹션은 저온 저온 이기보다는 얼어 붙은 뇌 블록에서 만들어집니다. 이렇게 하면 ROI 샘플을 수집하는 데 필요한 섹션 수가 줄어듭니다. 이 방법은 또한 절연 된 상자 내에서 드라이 아이스에 앉아 냉동 유리 판에 샘플을 해부. 이것은 작동할 벤치에서 서브 동결 단계를 생성합니다. 이러한 방식으로 해부된 섹션은 쉽게 조작할 수 있으므로 연구원은 원하는 ROI 외부 영역의 오염을 제한하기 위해 각 섹션의 양쪽을 참조와 비교할 수 있습니다.
이 프로토콜의 장점은 1) 뇌가 과정 전반에 걸쳐 동결 된 상태로 유지되어 단백질과 핵산을 보존하고 연구원에게 ROI를 신중하게 수확할 시간을 주며 2) 필요한 시약이 저렴하고 대부분의 분자 생물학 실험실에서 발견된다는 것입니다. 이 과정에서 전체 뇌는 뇌 매트릭스에서 0.5-1.0 mm로 단면화되고 드라이 아이스로 지속적으로 냉각되는 냉동 유리 판에 놓입니다. 알렌 브레인 아틀라스에서 발견 된 랜드 마크1 또는 다른 뇌 지도판16,,17 관심 영역을 식별하는 데 사용됩니다, 다음 차가운 펀치 또는 메스중 하나를 사용하여 해부되는. 조직이 결코 해동되지 않았기 때문에, 이러한 방식으로 수확된 부위는 다운스트림 분석을 위한 고품질 RNA 및 단백질을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 작품은 핵산과 단백질의 분해를 제한하면서 뇌의 작은 특정 영역을 분리하는 기술을 설명합니다. 뇌 조직의 손상은 유기체가 죽으면 빠르게 발생합니다. 이것은 부분적으로 세포 외 글루타민산염의 급속한 축적과21발생하는흥분독성에 기인한다. 메신저 RNA는 특히저하에 취약하다 22,,23. 단백질과 핵산의 분해는24년</su…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NIH, DA043982 및 DA046196에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 0.5 mm Mouse coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 505C | Cutting block |
| 0.5 mm Rat coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 705C | Cutting block |
| 1.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-01 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Dot Scientific | 229443 | For storing frozen ROIs |
| 1.5 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-02 | |
| 2.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-03 | |
| 4-12% NuPage gel | Invitrogen | NPO323BOX | protein gradient gel |
| Bioanalyzer System | Agilent | 2100 | RNA analysis system |
| Dounce tissue grinder | Millipore Sigma | D8938 |
Glass tissue homogenizer |
| Dry Ice | |||
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner Industries Inc. | Model 180 | Cool lamp |
| Glass plates | LabRepCo | 11074010 | |
| HALT | ThermoFisher | 78440 | protease inhibitor cocktail |
| Low profile blades | Sakura Finetek USA Inc. | 4689 | |
| mouse anti-actin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | JLA20 | Antibody |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Used in initial RNA purity analysis |
| No. 15 surgical blade | Surgical Design Inc | 17467673 | |
| Odyssey Blocking buffer | LiCor Biosciences | 927-40000 | Western blocking reagent |
| Omni Tissue Master 125 | VWR | 10046-866 | Tissue homogenizer |
| rabbit anti-KCC2 antibody | Cell Signaling Technology | 94725S | Antibody |
| RNA Plus Micro Kit | Qiagen | 73034 | Used to extract RNA from small tissue samples |
| RNaseZap | Life Technologies | AM9780 | |
| Scalpel handle | Excelta Corp. | 16050103 | |
| Standard razor blades | American Line | 66-0362 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | Used to extract RNA from tissue |
Referencias
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