Coleção de regiões cerebrais de roedores congelados para análises a jusante
Summary
Este procedimento descreve a coleção de regiões cerebrais congeladas discretas para obter proteínas de alta qualidade e RNA usando ferramentas baratas e comumente disponíveis.
Abstract
À medida que nossa compreensão da neurobiologia progrediu, análises moleculares são frequentemente realizadas em pequenas áreas cerebrais, como o córtex pré-frontal medial (mPFC) ou núcleo accumbens. O desafio neste trabalho é dissecar a área correta, preservando o microambiente a ser examinado. Neste artigo, descrevemos um método simples e de baixo custo usando recursos prontamente disponíveis na maioria dos laboratórios. Este método preserva o ácido nucleico e as proteínas mantendo o tecido congelado durante todo o processo. Os cérebros são cortados em seções de 0,5 a 1,0 mm usando uma matriz cerebral e dispostos em uma placa de vidro congelada. Marcos dentro de cada seção são comparados a uma referência, como o Atlas do Cérebro do Rato Allen, e as regiões são dissecadas usando um bisturi frio ou um soco de biópsia. O tecido é então armazenado a -80 °C até o uso. Através desse processo, o mPFC de ratos e ratos, núcleo accumbens, hipocampo dorsal e ventral e outras regiões foram analisados com sucesso utilizando ensaios qRT-PCR e ocidentais. Este método está limitado a regiões cerebrais que podem ser identificadas por marcos claros.
Introduction
Este trabalho ilustra a dissecção de regiões cerebrais congeladas para extração de ácido nucleico ou proteína de alta qualidade usando uma referência, como o Allen Mouse Brain Atlas1, como guia. Nesta técnica, os cérebros são congelados e armazenados a -80 °C para secção posterior e dissecção enquanto são mantidos em uma condição congelada. Esse processo permite ao pesquisador colher um grande número de cérebros em uma sessão e depois dissecá-los para uma coleta precisa de múltiplas regiões cerebrais.
A coleta precisa de regiões cerebrais de interesse (ROIs) é frequentemente necessária ao responder perguntas relacionadas à expressão genética e proteica. Enquanto a farmacologia, a eletrofisiologia e a optogenética podem ser usadas em roedores selvagens ou geneticamente modificados para ajudar a elucidar mudanças moleculares que sustentam comportamentos observados2,3,4, a medição de alterações induzidas em transcriptomas e proteomas é frequentemente usada para apoiar esses achados. Técnicas como a reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR), a mancha ocidental, RNAseq5,MAPSeq6 e HPLC7 são robustas e relativamente baixas de custo, permitindo que muitos laboratórios estudem alterações moleculares induzidas em pequenas regiões cerebrais22,4,5,6.
Existem várias maneiras de extrair e purificar o ácido nucleico ou proteína das regiões cerebrais8,,9,,10,,11,12. Muitos laboratórios colhem regiões cerebrais resfriando e cortando cérebros no gelo no momento da colheita9,13. Embora essa abordagem possa resultar em ácido nucleico e proteína de alta qualidade, é um pouco limitada, pois a degradação dentro do microambiente do tecido pode ocorrer a essas temperaturas. Isso pode ser particularmente verdadeiro ao tentar dissecar um grande número de animais ou ROIs em uma sessão. Manter amostras congeladas ajuda a manter moléculas alvo labile, ao mesmo tempo em que fornece ao pesquisador tempo para comparar cuidadosamente marcos em ambos os lados de cada seção no esforço de coletar amostras relativamente puras. A captura a laser é outra forma de coletar tecido para RNA ou análise de proteínas de áreas cerebrais10. Este procedimento é superior à dissecção mecânica em que os ROIs muito pequenos e de forma irregular podem ser identificados e isolados. No entanto, a captura a laser é limitada pelo uso de equipamentos caros e reagentes, é demorada e também pode ser mais suscetível à degradação da amostra.
A dissecção de microperfuração em tecidos congelados não é nova. Os primeiros trabalhos de Miklos Palkovits e outros descrevem as técnicas básicas em detalhes14,15. Esta apresentação segue em grande parte o trabalho original, com algumas melhorias para facilitar a eficiência e diminuir o gasto com os equipamentos necessários. Por exemplo, seções cerebrais são feitas em um bloco cerebral congelado em vez de em um criostato. Isso produz seções mais grossas, o que reduz o número de seções necessárias para coletar amostras de ROI. Este método também disseca amostras em uma placa de vidro congelada que se senta em gelo seco dentro de uma caixa isolada. Isso produz uma fase de subcongelamento no banco em que trabalhar. As seções dissecadas dessa forma são facilmente manipuladas, permitindo ao pesquisador comparar ambos os lados de cada seção com uma referência, a fim de limitar a contaminação de regiões fora do ROI desejado.
As vantagens deste protocolo são que 1) o cérebro é mantido em uma condição congelada durante todo o processo, o que ajuda a preservar proteína e ácido nucleico e dá ao pesquisador tempo para colher cuidadosamente os ROIs, e 2) os reagentes necessários são baratos e são encontrados na maioria dos laboratórios de biologia molecular. Nesse processo, cérebros inteiros são seccionados em 0,5-1,0 mm em uma matriz cerebral e colocados em uma placa de vidro congelada que é continuamente resfriada com gelo seco. Marcos encontrados no Atlas do Cérebro Allen1 ou em outros atlas cerebrais16,17 são usados para identificar regiões de interesse, que são então dissecadas usando um soco frio ou bisturi. Como o tecido nunca é descongelado, as regiões colhidas dessa forma fornecem RNA de alta qualidade e proteína para análises a jusante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabalho descreve uma técnica para isolar pequenas regiões específicas do cérebro, limitando a degradação do ácido nucleico e da proteína. Danos aos tecidos cerebrais acontecem rapidamente quando um organismo morre. Isto deve-se, em parte, ao rápido acúmulo de glutamato extracelular e à excitotoxicidade resultante que ocorre21. O RNA mensageiro é particularmente vulnerável à degradação22,23. A discriminação de prote?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo NIH, DA043982 e DA046196.
Materials
| 0.5 mm Mouse coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 505C | Cutting block |
| 0.5 mm Rat coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 705C | Cutting block |
| 1.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-01 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Dot Scientific | 229443 | For storing frozen ROIs |
| 1.5 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-02 | |
| 2.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-03 | |
| 4-12% NuPage gel | Invitrogen | NPO323BOX | protein gradient gel |
| Bioanalyzer System | Agilent | 2100 | RNA analysis system |
| Dounce tissue grinder | Millipore Sigma | D8938 |
Glass tissue homogenizer |
| Dry Ice | |||
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner Industries Inc. | Model 180 | Cool lamp |
| Glass plates | LabRepCo | 11074010 | |
| HALT | ThermoFisher | 78440 | protease inhibitor cocktail |
| Low profile blades | Sakura Finetek USA Inc. | 4689 | |
| mouse anti-actin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | JLA20 | Antibody |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Used in initial RNA purity analysis |
| No. 15 surgical blade | Surgical Design Inc | 17467673 | |
| Odyssey Blocking buffer | LiCor Biosciences | 927-40000 | Western blocking reagent |
| Omni Tissue Master 125 | VWR | 10046-866 | Tissue homogenizer |
| rabbit anti-KCC2 antibody | Cell Signaling Technology | 94725S | Antibody |
| RNA Plus Micro Kit | Qiagen | 73034 | Used to extract RNA from small tissue samples |
| RNaseZap | Life Technologies | AM9780 | |
| Scalpel handle | Excelta Corp. | 16050103 | |
| Standard razor blades | American Line | 66-0362 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | Used to extract RNA from tissue |
Referencias
- . Allen Mouse Brain Atlas Available from: https://mouse.brain (2008)
- Kuleshova, E. P. Optogenetics – New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).
- Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930 (2009).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome. Cerebral cortex. 25 (10), 3743-3757 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kebschull, J. M., et al. High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA. bioRxiv. , 054312 (2016).
- Mitulović, G., Mechtler, K. HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).
- Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC Research Notes. 4, 314 (2011).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. JoVE. (7), e269 (2007).
- Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C., Murran, G. . Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1723, 2457 (2018).
- Björk, K., et al. Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity. The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).
- Jeong, H., et al. Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia. Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).
- Spijker, S., Li, K. W. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics, Neuromethods. 57, 13-26 (2011).
- Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 59, 449-450 (1973).
- Palkovits, M. . Methods in Enzymology. 103, 368-376 (1983).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , (2001).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , (1998).
- RNaseZap. Ambion Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ (2008)
- . RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control Available from: https://www.agilent.com/cs/library/ (2016)
- Scheyer, A. F., et al. Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors. Biological Psychiatry. , (2019).
- Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).
- Guhaniyogi, J., Brewer, G. Regulation of mRNA stability in mammalian cells. Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PloS One. 8 (2), 56507 (2013).
- Yamagata, K., et al. Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging. Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).
- Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas (2008)
