Apoptose-Induktion und Detektion in einer primärer Kultur von Seegurken-Darmzellen
Summary
Dieses Protokoll bietet eine einfach zu handhabende Methode zur Kultur der Darmzellen der Seegurke Apostichopus japonicus und ist mit einer Vielzahl von weit verbreiteten Gewebeproben von Meeresorganismen wie Echinodermata, Mollusca und Crustacea kompatibel.
Abstract
Primärkultivierte Zellen werden in einer Vielzahl von wissenschaftlichen Disziplinen als außerordentlich wichtige Instrumente zur funktionellen Bewertung biologischer Substanzen oder zur Charakterisierung spezifischer biologischer Aktivitäten eingesetzt. Aufgrund des Mangels an universell anwendbaren Zellkulturmedien und -protokollen sind gut beschriebene Zellkulturmethoden für Meeresorganismen jedoch nach wie vor begrenzt. Unterdessen behindern die häufig auftretende mikrobielle Kontamination und die polytropen Eigenschaften von wirbellosen Meereszellen die Etablierung einer wirksamen Zellkulturstrategie für marine Wirbellose weiter. Hier beschreiben wir eine einfach zu handhabende Methode zur Kultivierung von Darmzellen aus der Seegurke Apostichopus japonicus; Darüber hinaus stellen wir ein Beispiel für In-vitro-Apoptose-Induktion und Nachweis in primär kultivierten Darmzellen bereit. Darüber hinaus liefert dieses Experiment Details über die geeignete Kulturmedium- und Zellsammlungsmethode. Das beschriebene Protokoll ist mit einer Vielzahl von weit verbreiteten Gewebeproben von Meeresorganismen wie Echinodermata, Mollusca und Crustacea kompatibel und kann ausreichend Zellen für mehrere In-vitro-Experimente bereitstellen. Diese Technik würde es Forschern ermöglichen, primäre Zellkulturen von wirbellosen Meerestieren effizient zu manipulieren und die funktionelle Bewertung gezielter biologischer Materialien an Zellen zu erleichtern.
Introduction
Das Kultivieren von Zellen unter künstlich kontrollierten Bedingungen und nicht in ihrer natürlichen Umgebung liefert einheitliche versuchsweise Materialien für biologische Studien, insbesondere für Arten, die in einer Laborumgebung nicht leicht kultiviert werden können. Meereswirbellose machen mehr als 30% aller Tierarten1aus und liefern zahlreiche biologische Materialien für die Durchführung von Forschungsarbeiten über die Regulierungsmechanismen spezifischer biologischer Prozesse, wie Regeneration2,3, Stressreaktion4und Umweltanpassung5,6.
Die Seegurke Apostichopus japonicusist eine der am meisten untersuchten Stachelhäuleiterarten, die gemäßigte Gewässer entlang der Nordpazifikküste bewohnen. Es ist bekannt als eine kommerziell wichtige Art und marikultiviert in großem Maßstab in Ostasien, vor allem in China7. Zahlreiche wissenschaftliche Fragen zu A. japonicus, einschließlich der regulatorischen Mechanismen, die der Darmregeneration nach der Ausweidung8 und Degeneration in der Aestivation9, Metabolische Kontrolle10,11und Immunantwort12,13 unter thermischen oder pathogenen Belastungen zugrunde liegen, haben die Aufmerksamkeit der Forscher auf sich gezogen. Im Vergleich zu gut untersuchten Modelltieren ist die Grundlagenforschung, insbesondere auf zellulärer Ebene, jedoch durch technische Engpässe, wie z. B. das Fehlen fortgeschrittener Zellkulturmethoden, begrenzt.
Die Forscher haben sich viel Mühe gegeben, Zelllinien zu etablieren, aber sie haben auch viele Herausforderungen und keine Zelllinie von einem marinen Wirbellosen hat noch14etabliert. Jedoch, primäre Zellkulturen von marinen wirbellosen Tieren haben in den letzten Jahrzehnten15,16, und sie haben eine Gelegenheit für Experimente auf zellulärer Ebene zur Verfügung gestellt. Zum Beispiel wurde das regenerierende Intesin von A. japonicus als Quelle von Zellen für langfristige Zellkulturen verwendet, die eine praktische Methode für die primäre Zellkultur von marinen Wirbellosen17zur Verfügung stellten. Dieses Protokoll kombinierte und optimierte wirbellose Zellkultur Ansätze und entwickelte eine weit geeignete Primärkulturmethode für Seegurken oder andere marine Wirbellose.
Apoptose ist ein intrinsisches Zellselbstmordprogramm, das durch verschiedene exogene und endogene Reize ausgelöst wird. Koordinierte Apoptose ist entscheidend für viele biologische Systeme18,19, und es wurde in die Darmregression der Seegurke während der Aestivationbeteiligt 9. Zur Untersuchung des apoptotischen Prozesses bei Organismen von Interesse wurden eine Reihe von Methoden, einschließlich Hoechst-Färbungs- und Mikroskopie-Assays, etabliert und erfolgreich angewendet20. Hier führten wir Apoptose-Induktion und -Nachweis in primär kultivierten Darmzellen von Seegurken durch, um die Verwendbarkeit von Primärzellen in biologischen Studien von wirbellosen Meerestieren zu bewerten. Dexamethason, eines der häufig verwendeten synthetischen Glukokortikosteroide21, wurde verwendet, um Apoptose in kultivierten Darmzellen aus Seegurken zu induzieren, und signifikante Shoechst 33258 Signal wurde erfolgreich in den gefärbten Zellen durch fluoreszierende Mikroskopie nachgewiesen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Umfangreiche Forschungsanstrengungen wurden in den letzten Jahrzehnten zur Etablierung von Zelllinien unternommen, es ist jedoch immer noch schwierig, Fortschritte bei der langfristigen Kultur von Zellen von marinen Wirbellosen zu machen14,22. Es wurde berichtet, dass kultivierte Zellen aus regenerierenden holothurischen Geweben über einen langen Zeitraum lebensfähig waren und eine hohe Proliferationsaktivität in bestimmten Zellen nachgewiesen werden kann<sup …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Prof. Naiming Zhou von der Universität Zhejiang für seine technische Beratung und für die Bereitstellung der Ausstattung seines Labors. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nummern 41876154, 41606150 und 41406137) und den Fundamental Research Funds for Zhejiang Provincial Universities and Research Institutes (Grant-Nummer 2019JZ00007) und den Fundamental Research Funds for Zhejiang Provincial Universities and Research Institutes [Grant-Nummer 2019JZ00007) finanziell unterstützt. ].
Materials
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
Referencias
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