해삼 장 세포의 1 차적인 배양에 있는 세포자멸 유도 그리고 탐지
Summary
이 프로토콜은 해삼 Apostichopus japonicus에서 장 세포를 배양하는 다루기 쉬운 방법을 제공하며 에키노더마타, 연체 동물 및 갑각류를 포함한 해양 생물에서 널리 이용 가능한 다양한 조직 샘플과 호환됩니다.
Abstract
1 차 배양 세포는 생물학적 물질의 기능적 평가 또는 특정 생물학적 활동의 특성화를 위한 매우 중요한 도구로서 다양한 과학 분야에서 사용된다. 그러나, 보편적으로 적용 가능한 세포 배양 배지 및 프로토콜의 부족으로 인해, 해양 생물에 대한 잘 설명된 세포 배양 방법은 여전히 제한적이다. 한편, 해양 무척추 동물 세포의 일반적으로 발생하는 미생물 오염 및 다색 특성은 해양 무척추 동물에 대한 효과적인 세포 배양 전략의 수립을 더욱 방해합니다. 여기서, 우리는 해삼 Apostichopus japonicus에서장 세포를 배양하기위한 다루기 쉬운 방법을 설명합니다. 추가적으로, 우리는 1 차적인 배양된 장 세포에 있는 시험관 내 apoptosis 유도 그리고 탐지의 보기를 제공합니다. 더욱이, 본 실험은 적절한 배양 배지 및 세포 수집 방법에 대한 세부정보를 제공한다. 기재된 프로토콜은 에키노더마타, 연체루스카 및 갑각류를 포함한 해양 생물로부터 널리 이용 가능한 다양한 조직 샘플과 호환되며, 여러 체외 실험 응용 분야에 충분한 세포를 제공할 수 있다. 이 기술은 연구원이 해양 무척추 동물에서 1 차적인 세포 배양을 능률적으로 조작하고 세포에 표적으로 한 생물학 물질의 기능적인 평가를 촉진하기 위하여 가능하게 할 것입니다.
Introduction
인위적으로 통제된 조건하에서 세포를 배양하는 것은 자연 환경이 아니라 생물학적 연구를 위한 균일한 실험 물질을 제공하며, 특히 실험실 환경에서 쉽게 배양할 수 없는 종에 대해 균일한 실험 물질을 제공합니다. 해양 무척추 동물은 모든 동물 종의 30 % 이상을차지하며,재생2,3,스트레스 반응 4 및 환경 적응5,6과같은 특정 생물학적 과정의 규제 메커니즘에 대한 연구를 수행하기위한 수많은 생물학적 물질을 제공합니다.
해삼, 아포스코푸스 japonicus,북태평양 해안을 따라 온대 바다를 서식하는 가장 연구 된 echinoderm 종 중 하나입니다. 그것은 잘 상업적으로 중요한 종으로 알려져 있으며, 특히 중국7,동아시아에서 대규모로 마리 컬쳐. A. japonicus에관한 수많은 과학적 질문, 억제 후 장 재생 기본 규제메커니즘을 포함 하 여 8 및 aestivation에서 변성9,대사 제어10,11,그리고 면역 반응12,13 열 또는 병원 성 스트레스 에서, 연구원의 관심을 끌고 있다. 그러나, 잘 연구된 모형 동물과 비교해, 기초 연구, 특히 세포 수준에, 고급 세포 배양 방법의 부족과 같은 기술적인 병목 현상에 의해 제한됩니다.
연구원은 세포주 를 확립하기 위하여 많은 노력을 바쳤습니다, 그러나 또한 많은 도전을 직면하고 어떤 해양 무척추 동물에게서 세포주도 아직14설치되지않았습니다. 그러나, 해양 무척추 동물에서 1 차적인 세포 배양은 지난 수십 년 동안15,16에서진보하고, 그(것)들은 세포 수준에 실험을 위한 기회를 제공했습니다. 예를 들어, A. japonicus로부터의 재생 인테신은 해양 무척추동물(17)의1차 세포 배양에 대한 실용적인 방법을 제공하는 장기 세포 배양용 세포의 공급원으로 활용되고 있다. 이 프로토콜은 결합및 최적화된 무척추동물 세포 배양 접근법과 해삼 또는 다른 해양 무척추동물에 대한 널리 적합한 1차 배양 방법을 개발하였다.
세포 사멸은 다양한 외인성 및 내인성 자극에 의해 유발되는 본질적인 세포 자살 프로그램입니다. 조율된 아포토시스는 많은 생물학적 계에18,19,및 수거 9 시 동안 해삼의 장 회귀에 연루되어있다. 관심있는 유기체에서 세포 사멸 과정을 조사하기 위해 Hoechst 염색 및 현미경 분석법을 포함한 일련의 방법이20개 확립되고 성공적으로 적용되었습니다. 여기에서, 우리는 해양 무척추 동물의 생물학 연구결과에 있는 1 차적인 세포의 유용성을 평가하기 위하여 해삼의 1 차배양된 장세포에서 apoptosis 유도 그리고 탐지를 실시했습니다. 일반적으로 사용되는 합성 글루코코르티코스테로이드(21) 중하나인 덱사메타손은 해삼에서 배양된 장세포에서 세포사멸을 유도하는데 사용되었으며, 현저한 Hoechst 33258 신호는 형광 현미경검사법에 의해 염색된 세포에서 성공적으로 검출되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
광범위한 연구 노력은 지난 수십 년 동안 세포주 확립에 전념해 왔지만, 해양 무척추 동물14,22로부터세포의 장기 배양에 진전을 이루기는 여전히 어렵다. 홀로투리안 조직을 재생시키는 것으로부터 배양된 세포는 장기간 생존가능하고 증식의 높은 활성이 특이적세포(17,23)에서검출될 수 있다고 보고되었다. ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그의 기술적 조언과 사용하기 위해 자신의 실험실의 장비를 만들기위한 절강 대학에서 Naiming 저우 교수에게 감사드립니다. 이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 41876154, 41606150, 및 41406137)과 절강 성 대학 및 연구 기관의 기초 연구 기금 [보조금 번호 2019JZ00007)에 의해 재정적으로 지원되었습니다. ].
Materials
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
Referencias
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