הכנת אלקטרודות גירוי עצבי היקפי להשתלה כרונית בחולדות
Summary
גישות קיימות לבניית אלקטרודות שרוול עצב היקפי מושתלים באופן כרוני לשימוש מכרסמים קטנים דורשים לעתים קרובות ציוד מיוחד ו/או כוח אדם מיומן. בפרוטוקול זה אנו מדגימים גישה פשוטה בעלות נמוכה לזיוף אלקטרודות שרוול מושתלות כרונית, ולהפגין את יעילותם לגירוי עצבי vagus (VNS) בחולדות.
Abstract
אלקטרודות שרוול עצב היקפי שימשו זמן רב במדעי המוח ובתחומים הקשורים לגירוי של, למשל, vagus או עצבים ירך. מספר מחקרים שנעשו לאחרונה הראו את היעילות של VNS כרוני בשיפור פלסטיות מערכת העצבים המרכזית כדי לשפר את השיקום המוטורי, למידה הכחדה, ואפליה חושית. בניית מכשירים מושתלים כרונית לשימוש במחקרים כאלה היא מאתגרת בשל גודלם הקטן של חולדות, פרוטוקולים טיפוסיים דורשים הכשרה נרחבת של כוח אדם ושיטות microfabrication גוזל זמן. לחלופין, אלקטרודות שרוול מושתלים זמינים מסחרית ניתן לרכוש בעלות גבוהה יותר באופן משמעותי. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה פשוטה בעלות נמוכה לבניית אלקטרודות קטנות, מושתלות באופן כרוני לשרוול ים היקפי לשימוש בחולדות. אנו מאמתים את האמינות לטווח הקצר והארוך של אלקטרודות השרוולים שלנו על ידי הדגמה כי VNS בחולדות מרדימים קטמין / xylazine מייצר ירידה בקצב הנשימה עולה בקנה אחד עם ההפעלה של רפלקס הינג-ברויר, הן בזמן ההשתלה ועד 10 שבועות לאחר השתלת המכשיר. אנו מדגימים עוד את התאמת אלקטרודות השרוול לשימוש במחקרי גירוי כרוני על ידי זיווג VNS עם ביצועי מכבש מנוף מיומנים כדי לגרום פלסטיות מפה קליפתית המנוע.
Introduction
לאחרונה, הביקוש אלקטרודות שרוול מושתלים כרונית לגירוי של עצבים היקפיים גדל, כמו מחקרים יותר ויותר להדגים את התועלת הקדם קלינית של טכניקה זו לטיפול במחלות דלקתיות רבות1,,2,,3 והפרעות נוירולוגיות4,,5,,6,7,,68,,9,,10,,11,,12,,13,,14,,15. VNS כרוני, למשל, כבר הראה כדי לשפר את הפלסטיות neocortical במגוון רחב של הקשרי למידה, שיפורשיקום מוטורי 4, 5,6,,7, 8,6,הכחדהלמידה 10,,11,12,13,,14, ואפליהחושית 15. אלקטרודות שרוול עצב היקפי זמין מסחרית קשורים לעתים קרובות עם זמנים ממושכים עבור מילוי הזמנה ועלויות גבוהות יחסית, אשר יכול להגביל את הנגישות שלהם. לחלופין, פרוטוקולים עבור “בתוך הבית” ייצור של אלקטרודות שרוול מושתלים כרונית נשארים מוגבלים, ואנטומיה מכרסמים מציג אתגרים מסוימים בשל גודלם הקטן. הפרוטוקולים הנוכחיים לבניית אלקטרודות שרוול לניסויים כרוניים מכרסמים לעתים קרובות דורשים שימוש בציוד וטכניקות מורכבים, כמו גם כוח אדם מאומן בהרחבה. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים גישה פשוטה לזיוף אלקטרודה שרוול מבוסס על שיטות שפורסמו בעבר בשימושנרחב 16,,17. אנו מאמתים את הפונקציונליות של האלקטרודות המושתלות באופן כרוני שלנו בחולדות על ידי הדגמה שבזמן השתלת השרוול סביב עצב התועה של צוואר הרחם השמאלי, גירוי שהוחל על אלקטרודות השרוולים יצר בהצלחה הפסקת נשימה וירידה ב-SpO2. גירוי של סיבי vagal קולטן ריאתי א-פרנטי ידוע לעסוק רפלקס הינג-ברויר, שבו עיכוב של גרעינים נשימתיים מספר בגזע המוח גורמת השראהדיכוי 18. לכן, הפסקת הנשימה עולה בקנה אחד עם רפלקס הינג-ברויר, ואת הירידה שנוצרה ב SpO2, לספק בדיקה פשוטה עבור השתלת אלקטרודה נכונה ותפקוד השרוול בחולדות מרדים. כדי לאמת את הפונקציונליות ארוכת הטווח של אלקטרודות שרוול מושתלות כרונית, תגובות רפלקס נמדדו בזמן ההשתלה בהשוואה לתגובות שהתקבלו באותם בעלי חיים שישה שבועות לאחר ההשתלה. קבוצה שנייה של חולדות הושתלה עם אלקטרודות שרוול VNS לאחר אימון התנהגותי במשימת לחיצה על ידית. בחולדות אלה, VNS בשילוב עם ביצועי המשימה הנכונים הפיק ארגון מחדש של מפת המנוע הקליפתי, עולה בקנה אחד עם מחקריםשפורסמו בעבר 19,20,21,22. בזמן מיפוי קליפתי מוטורי תחת הרדמה, אשר התרחש 5-10 שבועות לאחר השתלת המכשיר, אנו עוד יותר מאומתים פונקציית השרוול בבעלי חיים שטופלו VNS על ידי אישור כי VNS בהצלחה גרם הפסקת נשימה וירידה של יותר מ 5% SpO2.
הפרוטוקולים שפורסמו לאחרונה מ Childs et al.17 ו Rios ואח ‘.16 לספק נקודת התחלה מאומתת היטב עבור גישת ייצור אלקטרודה שרוול פשוטה, כמו שיטה פופולרית זו נוצלה על ידי מעבדות מרובות ביצוע מחקרי VNSכרוניים מכרסמים 1,2,,,3,,4,,5,6,,7,,8,,9,,10,11., השיטה המקורית כוללת מספר שלבים מדויקים למניפולציה של המיקרו-חוטים העדינים, כך שזיוף האלקטרודה של השרוולים לוקח יותר משעה להשלמתו, והכשרה מקיפה לביצועים אמינים. הגישה המפשטת המתוארת כאן דורשת פחות חומרים וכלים באופן משמעותי ותוכל להשלים אותה מתוך פחות משעה על ידי כוח אדם מיומן מינימלי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים גישה פשוטה בעלות נמוכה להרכבה של אלקטרודות שרוול מגרה כרונית לשימוש מכרסמים, הקלה על חקירות פרה-קוליות של טיפול זה המתעוררים. שיטה פשוטה זו לא דורשת הכשרה או ציוד מיוחדים, ומשתמשת במספר קטן של כלים ואספקה הנגישים בקלות לרוב מעבדות המחקר, מה שמפחית הן את עלויות העבודה הכספיות…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי אוניברסיטת טקסס בדאלאס ומועצת המנהלים של UT. אנו מודים לסולומון גולדינג, בייאל חסן, מרגי ג’אני וצ’ינג-צו-צנג על הסיוע הטכני.
Materials
| Biocompatible polyurethane-based polymer tubing, 0.080" OD x 0.040" ID | Braintree Scientific | MRE080 36 FT | |
| Dissecting microscope | AM Scopes | #SM-6T-FRL | |
| Fine Serrated Scissors, straight, 22mm cutting edge | Fine Science Tools | #14058-09 | for cutting Pt/Ir wire and suture thread |
| Forceps, #5 Dumont forceps, straight, 11 cm, 0.1 x 0.06 mm tip | Fine Science Tools | #11626-11 | |
| Forceps, ceramic tipped forceps, 0.3 mm x 30 mm tips | Electron Microscopy Sciences | #78127-71 | |
| Gold Pins, PCB Press Fit Socket | Mill-Max | #1001-0-15-15-30-27-04-0 | or similar small pins for connecting cuff leads to headcap |
| Isobutane lighter | BIC | #LCP21-AST | for de-insulating Pt/Ir wire |
| Micro strip connector with latch, 4-pin | Omnetics | A24002-004 / PS1-04-SS-LT | |
| Pipette tip, 10 uL | VWR | 89079-464 | |
| Platinum-Iridium (90/10%) Wire, 0.001" (diameter) x 9 strands, PTFE insulated | Sigmund Cohn | 10IR9/49T | |
| Razor Blade, Single Edge, Surgical Carbon Steel No.9 | VWR | #55411-050 | for cutting MicroRenathane tubing |
| Sewing needle, ca. 4.0 cm length x 0.7 mm diameter (size 6-7) | Singer | 00276 | Smaller needle for threading Pt/Ir wire |
| Sewing needle, ca. 4.5 cm length x 0.8 mm diameter (size 2-3) | Singer | 00276 | Larger needle for pinning cuff during assembly and for threading suture |
| Small foam board | Juvo+/Amazon | B07C9637SJ | for fabrication platform; our dimensions are ca. 2.5" x 3.5" x 1" (L x W x H) |
| Solder, multicore lead-free, 0.38mm diameter | Loctite/Multicore | #796037 | |
| Soldering station | Weller | WES51 | or similar soldering iron compatible with long conical tips (this part has been discontinued) |
| Soldering tip, long conical, 0.01" / 0.4 mm | Weller | 1UNF8 | |
| Suture, nonabsorbable braided silk ,size 6/0 | Fine Science tools | #18020-60 | |
| UV (405 nm) spot light | Henkel/Loctite | #2182207 | |
| UV Light Cure Adhesive 25 ml | Henkel/Loctite | AA 3106 | or similar biocompatible UV cure adhesive |
| Wire wrapping wire, 30 AWG | Digikey | K396-ND |
Referencias
- Koopman, F. A., et al. Vagus nerve stimulation inhibits cytokine production and attenuates disease severity in rheumatoid arthritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2016).
- Levine, Y. A., et al. Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis. PLoS One. , (2014).
- Zhang, Y., et al. Chronic vagus nerve stimulation improves autonomic control and attenuates systemic inflammation and heart failure progression in a canine high-rate pacing model. Circulation: Heart Failure. , (2009).
- Ganzer, P. D., et al. Closed-loop neuromodulation restores network connectivity and motor control after spinal cord injury. Elife. , (2018).
- Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training enhances recovery of forelimb function after ischemic stroke in aged rats. Neurobiology of Aging. , (2016).
- Khodaparast, N., et al. Vagus nerve stimulation delivered during motor rehabilitation improves recovery in a rat model of stroke. Neurorehabilitation and Neural Repair. , (2014).
- Meyers, E. C., et al. Vagus nerve stimulation enhances stable plasticity and generalization of stroke recovery. Stroke. , (2018).
- Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training improves functional recovery after intracerebral hemorrhage. Stroke. , (2014).
- Farrand, A., et al. Vagus nerve stimulation improves locomotion and neuronal populations in a model of Parkinson’s disease. Brain Stimulationation. , (2017).
- Souza, R. R., et al. Vagus nerve stimulation reverses the extinction impairments in a model of PTSD with prolonged and repeated trauma. Stress. , (2019).
- Noble, L. J., Souza, R. R., McIntyre, C. K. Vagus nerve stimulation as a tool for enhancing extinction in exposure-based therapies. Psychopharmacology. , (2019).
- Childs, J. E., Kim, S., Driskill, C. M., Hsiu, E., Kroener, S. Vagus nerve stimulation during extinction learning reduces conditioned place preference and context-induced reinstatement of cocaine seeking. Brain Stimulationation. , (2019).
- Peña, D. F., Engineer, N. D., McIntyre, C. K. Rapid remission of conditioned fear expression with extinction training paired with vagus nerve stimulation. Biological Psychiatry. , (2013).
- Childs, J. E., DeLeon, J., Nickel, E., Kroener, S. Vagus nerve stimulation reduces cocaine seeking and alters plasticity in the extinction network. Learning & Memory. , (2017).
- Engineer, C. T., et al. Temporal plasticity in auditory cortex improves neural discrimination of speech sounds. Brain Stimulationation. , (2017).
- Rios, M., et al. Protocol for Construction of Rat Nerve Stimulation Cuff Electrodes. Methods Protoc. , (2019).
- Childs, J. E., et al. Vagus nerve stimulation as a tool to induce plasticity in pathways relevant for extinction learning. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiological reviews. , (1973).
- Porter, B. A., et al. Repeatedly Pairing Vagus Nerve Stimulation with a Movement Reorganizes Primary Motor Cortex. Cerebral Cortex. 22, 2365-2374 (2011).
- Morrison, R. A., et al. Vagus nerve stimulation intensity influences motor cortex plasticity. Brain Stimulationation. , (2018).
- Hulsey, D. R., et al. Norepinephrine and serotonin are required for vagus nerve stimulation directed cortical plasticity. Exp. Neurol. , (2019).
- Hulsey, D. R., et al. Reorganization of Motor Cortex by Vagus Nerve Stimulation Requires Cholinergic Innervation. Brain Stimulation. 9, 174-181 (2016).
- Bouverot, P., Crance, J. P., Dejours, P. Factors influencing the intensity of the breuer-hering inspiration-inhibiting reflex. Respiration Physiology. , (1970).
- Fialova, E., Vizek, M., Palecek, F. Inflation reflex in the rat. Physiologia Bohemoslov. , (1975).
- Hays, S. A., et al. The bradykinesia assessment task: An automated method to measure forelimb speed in rodents. Journal of Neuroscience Methods. , (2013).
- Kim, H., et al. Cuff and sieve electrode (CASE): The combination of neural electrodes for bi-directional peripheral nerve interfacing. Journal of Neuroscience Methods. , (2020).
- González-González, M. A., et al. Thin Film Multi-Electrode Softening Cuffs for Selective Neuromodulation. Scientific Reports. , (2018).
- Thakur, R., Nair, A. R., Jin, A., Fridman, G. Y. Fabrication of a Self-Curling Cuff with a Soft, Ionically Conducting Neural Interface. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. , (2019).
- Bucksot, J., et al. Flat electrode contacts for vagus nerve stimulation. PLoS One. 14, (2019).
- El Tahry, R., et al. Repeated assessment of larynx compound muscle action potentials using a self-sizing cuff electrode around the vagus nerve in experimental rats. Journal of Neuroscience Methods. , (2011).
- Bonaz, B., Sinniger, V., Pellissier, S. Anti-inflammatory properties of the vagus nerve: potential therapeutic implications of vagus nerve stimulation. Journal of Physiology. , (2016).
