Preparação de extratos celulares por criogrinding em um moinho de congelador automatizado

Summary

Descrevemos um método confiável para a preparação de extratos celulares inteiros de leveduras ou outras células usando uma fábrica de congelador criogênico que minimiza a degradação e a desnaturação de proteínas. Os extratos celulares são adequados para purificação de complexos proteicos funcionais, análises proteômicas, estudos de co-imunoprecipitação e detecção de modificações de proteína labile.

Abstract

A facilidade da manipulação genética e a forte conservação evolutiva das máquinas celulares eucarióticas na levedura saccharomyces cerevisiae tornou-a um organismo modelo genético preeminente. No entanto, uma vez que o isolamento eficiente da proteína depende da interrupção ideal das células, o uso de levedura para análise bioquímica de proteínas celulares é dificultado por sua parede celular que é cara para digerir enzimaticamente (usando lyticase ou zymolyase), e difícil de interromper mecanicamente (usando um batedor de contas tradicional, uma prensa francesa ou um moedor de café) sem causar aquecimento de amostras, o que por sua vez causa denaturação e degradação de proteínas. Embora a moagem manual de células de levedura sob nitrogênio líquido (LN₂) usando uma argamassa e pilão evite o superaquecimento das amostras, é trabalhosa intensiva e sujeita à variabilidade na lise celular entre os operadores. Por muitos anos, temos preparado com sucesso extratos de levedura de alta qualidade usando criogrinding de células em uma fábrica de congelador automatizada. A temperatura de -196 °C alcançada com o uso da LN₂ protege o material biológico da degradação por proteases e núcleos, permitindo a recuperação de proteínas intactas, ácidos nucleicos e outras macromoléculas. Aqui descrevemos esta técnica em detalhes para células de levedura brotante que envolve primeiro o congelamento de uma suspensão de células em um tampão de lise através de sua adição dropwise em LN₂ para gerar gotículas congeladas de células conhecidas como “pipoca”. Esta pipoca é então pulverizada sob LN₂ em um moinho de congelador para gerar um extrato congelado “em pó” que é descongelado lentamente e esclarecido por centrifugação para remover detritos insolúveis. Os extratos resultantes estão prontos para aplicações a jusante, como purificação de proteínas ou ácidos nucleicos, análises proteômicas ou estudos de co-imunoprecipitação. Esta técnica é amplamente aplicável para a preparação de extratos celulares de uma variedade de microrganismos, tecidos vegetais e animais, espécimes marinhos, incluindo corais, bem como isolar DNA/RNA de espécimes fósseis forenses e permafrost.

Introduction

A levedura é um organismo modelo popular para estudos de proteínas, pois é um simples organismo eucariótico com abundância de ferramentas genéticas e bioquímicas disponíveis para pesquisadores¹. Por causa de sua parede celular resistente, um desafio que os pesquisadores enfrentam é desaformar as células sem danificar o conteúdo celular. Diferentes métodos estão disponíveis para a obtenção de extratos proteicos através da interrupção de células de levedura que incluem lise enzimática (zymolyase)^2,3, lise química⁴, lise física por congelamento^5,à base de pressão (imprensa francesa)^6,7, mecânica (contas de vidro, moedor de café)^8,9, baseado em sônicação¹⁰ e criogênico^2,11. A eficiência da lise celular e o rendimento da proteína podem variar consideravelmente dependendo da técnica empregada, afetando assim o resultado final ou a adequação para a aplicação a jusante desejada para o lise. Ao estudar proteínas instáveis, ter modificações pós-transacionais fugazes ou sensíveis à temperatura, é particularmente importante usar um método que minimize a perda ou a degradação da amostra durante a preparação.

Técnica de preparação de extrato	Detalhes	Vantagens	Desvantagens	Análise a jusante	Referência
Imprensa francesa: Homogeneizador de alta pressão (também conhecido como Microfluidizer) com pré-tratamento enzimático usando Zymolyase	Zymolyase-20T, um homogeneizador de alta pressão microfluidizador. O disruptor consiste em uma bomba de alta pressão acionada a ar (razão 1:250; pressão de ar necessária 0,6-l MPa) e uma câmara de interrupção especial com uma unidade de pressão traseira adicional. É necessário um tamanho amostral mínimo de 20 mL para o processamento.	A interrupção total final obtida usando o protocolo combinado aproximou-se de 100 % com 4 passes a uma pressão de 95 MPa, em comparação com apenas 32 % de interrupção com 4 passes a 95 MPa usando apenas homogeneização sem o Zymolyase.	Não é apropriado para aplicações em pequena escala. As enzimas podem ficar caras para preparações em grande escala.	Purificação de proteínas	6
Batedor de contas: células tratadas com zymolyase com contas de vidro em um instrumento fastprep	Aproximadamente um volume igual de contas de vidro frias, secas e lavadas com ácido é adicionado a um determinado volume de pelotas de célula no tampão de lise e as células são interrompidas por uma agitação manual vigorosa.	É particularmente útil ao fazer extratos de muitas culturas de leveduras pequenas diferentes para fins de ensaio, em vez de para purificação de proteínas.	Durante o procedimento das contas de vidro, as proteínas são tratadas severamente causando espuma extensiva levando à desnaturação proteica. A quantidade de quebra celular varia, enquanto a proteólise, bem como a modificação das proteínas podem resultar do aquecimento do extrato acima de 4°C durante a quebra mecânica.	Principalmente análises de DNA e RNA, mas também análises de proteínas por eletrofiorese de gel desnaturing, com ou sem manchas ocidentais.	8
Tratamento zymolyase seguido de lise usando uma combinação de choque osmótico e homogeneização do Dounce	Após a digestão enzimática das paredes celulares, os esferoplastos são líssedos com 15 a 20 traçados de um pilão apertado (folga de 1 a 3 μm) em um homogeneizador do Dounce.	Vantajoso para o uso de cepas deficientes protease, como BJ926 ou EJ101. Esta é a maneira mais suave de quebrar células de levedura e, portanto, é mais adequada para o preparo de extratos que podem realizar funções enzimáticas complexas (por exemplo, tradução, transcrição, replicação de DNA) e em que a integridade das estruturas macromoleculares (por exemplo, ribossomos, emendas) deve ser mantida. Também é útil para isolar núcleos intactos que podem ser usados para estudos de cromatina (Bloom and Carbon, 1982) ou para extratos de proteína nuclear (Lue e Kornberg, 1987).	As principais desvantagens do procedimento de lise esferoplastia são que ele é relativamente tedioso e caro, especialmente para preparações em larga escala (>10 litros), e os longos períodos de incubação podem levar à proteólise ou modificação de proteínas.  Para as preparações de cromatina, elas parecem ser de qualidade variada ou inferior às produzidas pela centrifugação diferencial (baseada na integridade da escada nucleossomo).	Isolando núcleos intactos para estudos de cromatina, extratos que podem realizar funções enzimáticas complexas, extratos que requerem a integridade de estruturas macromoleculares, extratos de proteínanuclear.	2
Interrupção celular de células congeladas flash moendo em nitrogênio líquido usando uma argamassa/pilão ou um liquidificador	As células são congeladas imediatamente em nitrogênio líquido e depois líricas moendo manualmente em uma argamassa usando um pilão, ou usando um liquidificador Waring na presença de nitrogênio líquido.	O protocolo é rápido e fácil. Pode acomodar quantidades variadas de células de levedura, incluindo culturas muito grandes. Sua principal vantagem é que as células são imediatamente retiradas do estado de crescimento ativo em nitrogênio líquido (−196°C), diminuindo as atividades de enzimas degradativas, como proteases e nucleases, bem como atividades que modificam proteínas (por exemplo, fosfates e quinases). É particularmente adequado para fazer extratos de células inteiras a partir de uma única cultura de levedura para purificação de proteínas em larga escala.	Um pouco confuso e potencialmente perigoso para o investigador descuidado. Pequenas amostras (ou seja, culturas de levedura de 10 a 100 ml) não são facilmente processadas porque não há massa suficiente de aglomerados de células congeladas para fraturar efetivamente no liquidificador. É demorado processar amostras individuais e limpar o equipamento entre os usos.	Extratos de células inteiras de uma única cultura de levedura para purificação de proteínas em larga escala.	2
Autolise, fábrica de contas	pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm / Ø 0,5 mm, 5 × 3 min/3 min	Lise rápida e eficiente, especialmente para preparação de extratos em pequena escala	A geração de calor leva à desnaturação e degradação das macromoléculas. Equipamento de espancamento de contas necessário.	Análises em pequena escala.	10
Autolise, Sonicação	pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm, 4 × 5 min/2 min, pulser 80%, potência 80%	Os equipamentos de sonicação geralmente estão disponíveis na maioria das instituições.	A geração de calor leva à desnaturação e degradação das macromoléculas. Equipamento de sonicação necessário. A lise lenta pode levar mais de 24 horas.	Preparações da parede celular de levedura.
Processo de ebulição e congelamento	Nenhum equipamento especializado é necessário além de um freezer padrão e um bloco de aquecimento ou banho de água quente.	Eficiente, reprodutível, simples e barato.	A geração de calor leva à desnaturação e degradação das macromoléculas.	Análises de DNA por PCR.	5

Tabela 1: Comparação dos métodos disponíveis para a preparação de extratos de levedura.

A criogrinding (também conhecida como moagem criogênica/moagem criogênica) é comumente empregada para recuperar ácidos nucleicos, proteínas ou produtos químicos de amostras sensíveis à temperatura de forma confiável para análises quantitativas ou qualitativas. Tem sido usado com sucesso para múltiplas aplicações em diversas áreas, incluindo biotecnologia, toxicologia, ciência forense^12,13, ciência ambiental, biologia vegetal¹⁴ e ciência de alimentos. O isolamento de macromoléculas biológicas intactas é geralmente criticamente dependente da temperatura. Temperaturas extremamente baixas garantem que as proteases e núcleos permaneçam inativos, resultando em um isolamento confiável de proteínas intactas, ácidos nucleicos e outras macromoléculas para análises subsequentes. De fato, um moinho de congelador normalmente mantém uma temperatura amostral de -196 °C (o ponto de ebulição da LN₂), minimizando assim o DNA/RNA ou desnaturação e degradação de proteínas.

A fábrica de congeladores emprega uma câmara de moagem eletromagnética que move rapidamente uma barra de metal sólido ou cilindro para frente e para trás dentro de um frasco contendo a amostra a ser pulverizada entre plugues finais de aço inoxidável. O instrumento cria e rapidamente inverte um campo magnético dentro da câmara de moagem. À medida que o campo magnético muda para frente e para trás, o ímã esmaga a amostra contra os plugues, alcançando assim o “criogrinding” e a pulverização da pipoca. A fábrica de congeladores substitui a argamassa e o pilão e permite o processamento sequencial de várias amostras (ou até 4 amostras menores simultaneamente) com alta reprodutibilidade e evita a variabilidade usuário-usuário associada à moagem manual. Uma vez que as amostras são processadas, os extratos celulares podem ser usados para uma variedade de aplicações a jusante.

Protocol

1. Preparação de Pipoca de Levedura Cultivar células de levedura em 0,5 L de mídia YPD a uma densidade de 1 x 107 células/mL. Conte células usando um Contador Coulter ou qualquer outro meio. Centrífugas por 10 min a 2.400 g e 4 °C. Lave cada amostra uma vez com 500 mL de água desionizada de gelo 18 mega Ohm Milli-Q. Pelotas resuspend em 15 mL de tampão de lyse gelado [20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 110 mM KCl, 0,1% Tween, 10% glicerol, com agente redutor recém-adicio…

Representative Results

Comparamos dois métodos diferentes para a lise celular de levedura, a moagem de contas de vidro a 4 °C e um método automatizado de criogrinding a -196 °C, para avaliar as proteínas de recuperação relativa nos extratos celulares preparados com ambos os métodos. Para este estudo, optou-se por usar uma levedura brotante YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi3 -Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB39] [pUB221])16</su…

Discussion

Uma limitação de estudar proteínas nativas a partir de levedura é a lise ineficiente das células de levedura devido à sua parede celular resistente. Embora vários métodos tenham sido desenvolvidos, o método mais consistente e eficiente em nossas mãos é o criogrinding de células de leveduras flash congelado como pipoca. Este método permite a preparação confiável de extratos celulares inteiros de alta qualidade de levedura brotante em comparação com outros métodos de lise. Os resultados representativos d…

Materials

50 mL polycarbonate tubes with screw caps	Beckman	357002	Centrifuge tubes
BD Bacto Peptone	BD Biosiences	211677	Yeast YPD media component
BD Bacto Yeast Extract	BD Biosiences	212750	Yeast YPD media component
Beckman Avanti centrifuge	Beckman	B38624	High speed centrifuge
Beckman JLA-9.1000	Beckman	366754	Rotor
D-(+)-Dextrose Anhydrous	MP Biomedicals	901521	Yeast YPD media component
Eppendorf A-4-44	Eppendorf	22637461	Swinging bucket rotor
Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R	Eppendorf	22625101	Refrigerated centrifuge
Glycerol	SIGMA-ALDRICH	G5150-1GA	Volume excluder and cryoprotectant
HEPES	FisherBiotech	BP310-100	Buffer
HIS6 antibody	Novagen	70796	Antibody for HIS tag
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541-1KG	Salt for maintaining ionic strength
MG-132	CALBIOCHEM	474790	Proteasome Inhibitor
Phosphatase inhibitor cocktail	ThermoFisher Scientific	A32957	Phosphatase inhibitor cocktail
Ponceau S	SIGMA	P7170-1L	Protein Stain
Protease inhibitor cocktail	ThermoFisher Scientific	A32963	Protease inhibitor cocktail
Rotor JLA 25.500	Beckman	JLA 25.500	Rotor
Sodium Butyrate	EM Science	BX2165-1	Histone Deacetylase Inhibitor
Sodium Fluoride	Sigma-Aldrich	S6521	Phosphatase Inhibitor
Sodium Vanadate	MP Biomedicals	159664	Phosphatase Inhibitor
Sodium β-glycerophosphate	Alfa Aesar	13408-09-8	Phosphatase Inhibitor
Spex Certiprep 6850 freezer mill	SPEX Sample Prep	6850	Freezer Mill
TALON Metal Affinity Resin	BD Biosiences	635502	For pulling down HIS tagged proteins
Tween 20	VWR International	VW1521-07	Non-ionic detergent
β-Mercaptoethanol	AMRESCO	M131-250ML	Reducing agent