Оценка показателей синтеза белка de novo в Caenorhabditis elegans
Summary
Здесь мы вводим и описываем нерадиоактивный и неинвазивный метод оценки синтеза белка de novo in vivo, используя нематоды caenorhabditis elegans и восстановление флуоресценции после фотоблейлинга (FRAP). Этот метод можно комбинировать с генетическими и/или фармакологическими экранами для выявления новых модуляторов синтеза белка.
Abstract
Поддержание здорового протеома имеет важное значение для клеток и организма гомеостаза. Возмущение баланса между белково-трансляционным контролем и деградацией провоцирует множество возрастных заболеваний. Снижение механизмов контроля качества протеостаза является отличительной чертой старения. Биохимические методы обнаружения синтеза белка de novo по-прежнему ограничены, имеют ряд недостатков и не могут быть выполнены в живых клетках или животных. Caenorhabditis elegans, будучи прозрачным и легко генетически модифицированных, является отличной моделью для мониторинга темпов синтеза белка с помощью методов визуализации. Здесь мы представляем и описываем метод измерения синтеза белка de novo in vivo с использованием восстановления флуоресценции после фотоотливания (FRAP). Трансгенные животные, выражаюющие флуоресцентные белки в определенных клетках или тканях, облучаются мощным источником света, что приводит к фотоотбелу флуоресценции. В свою очередь, оценка восстановления флуоресценции означает новый синтез белка в клетках и/или тканях, представляющих интерес. Таким образом, сочетание трансгенных нематод, генетических и/или фармакологических вмешательств вместе с живой визуализацией скорости синтеза белка может пролить свет на механизмы, ососредуемые возрастной крах протеостаза.
Introduction
Синтез и деградация белка имеет важное значение для организма гомеостаза. Множество возрастных заболеваний вызваны дефектным производством белка1,,2. Для того, чтобы измерить глобальные темпы перевода белка, Существуют биохимические методы, такие как рибосомное профилирование, которое включает в себя глубокое секвенирование рибосомно-защищенных фрагментов мРНК для мониторинга экспрессии, а такжесинтеза нового белка 3. Этот метод, помимо того, что он является косвенным считыванием переводческих ставок, поскольку увеличение ассоциации РНК с рибосомами не обязательно означает увеличение перевода, имеет технические недостатки, такие, как высокая стоимость и требование большого количества исходного материала. С другой стороны, методы, основанные на протеомике, позволяют напрямую количественно оценить белок путем метаболического профилирования импульса, за которымследует анализ масс-спектрометрии 4,,5. Однако это полуколичеспособный подход с ограниченным временным разрешением, который не может быть легко использован in vivo. Кроме того, маркировка белка может быть неравномерно распределена в животных / тканей, представляющих интерес. Важно отметить, что оба эти метода могут скрывать специфические или клеточные изменения в ставках перевода белка у целых животных или тканей, соответственно.
Caenorhabditis elegans является простой в использовании модель организма, который может быть выращен в больших количествах6. Кроме того, его генетическая подмена и прозрачность позволяют живую визуализацию в vivo. Этот протокол описывает методологию обнаружения показателей синтеза белка с помощью восстановления флуоресценции после фотоблейлинга (FRAP). Мы пользуемся трансгенной экспрессией флуоресцентных белков, либо во всем организме, либо в определенных тканях/клетках. Трансгенные животные могут либо выразить GFP с помощью промоутера гена, который широко / глобально выражается или ткани конкретных промоутер для целевых конкретных типов клеток. Этот метод может быть распространен на конкретного промоутера для изучения темпов синтеза белка конкретного белка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модуляция синтеза белка имеет важное значение для организма гомеостаза. Во время старения, глобальный, а также специфический синтез белка возмущен. Недавние исследования показывают тот факт, что баланс перевода белка непосредственно контролирует старение и старение не просто побочны…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Чаниотакиса М. и Кунакиса К. за видеозапись и редактирование. К.П. финансируется за счет гранта Греческого фонда исследований и инноваций (HFRI) и Генерального секретариата по исследованиям и технологиям (GSRT). N.T. финансируется за счет грантов Европейского исследовательского совета (ERC – GA695190 – MANNA), Рамочной программы Европейской комиссии и Министерства образования Греции.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
Referencias
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, 75-89 (2015).
- Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
- Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genética. 200 (2), 387-407 (2015).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo. PLoS One. 4 (2), 4547 (2009).
- Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
- Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
- Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).
- Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).
- Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).
