Evaluación de las tasas de síntesis de proteínas de novo en Caenorhabditis elegans
Summary
Aquí, introducimos y describimos un método noradioactivo y no invasivo para evaluar la síntesis de proteínas de novo in vivo, utilizando el nematodo Caenorhabditis elegans y la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP). Este método se puede combinar con pantallas genéticas y/o farmacológicas para identificar nuevos moduladores de la síntesis de proteínas.
Abstract
Mantener un proteomo saludable es esencial para la homeostasis celular y del organismo. La perturbación del equilibrio entre el control traslacional de proteínas y la degradación instiga una multitud de enfermedades relacionadas con la edad. La disminución de los mecanismos de control de calidad de la proteostasis es un sello distintivo del envejecimiento. Los métodos bioquímicos para detectar la síntesis de proteínas de novo siguen siendo limitados, tienen varias desventajas y no se pueden realizar en células vivas o animales. Caenorhabditis elegans, siendo transparente y fácilmente modificado genéticamente, es un excelente modelo para monitorear las tasas de síntesis de proteínas mediante el uso de técnicas de imagen. Aquí, introducimos y describimos un método para medir la síntesis de proteínas de novo in vivo utilizando la recuperación de fluorescencia después del fotoblancarte (FRAP). Los animales transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en células o tejidos específicos son irradiados por una poderosa fuente de luz que resulta en fotoblancarse de fluorescencia. A su vez, la evaluación de la recuperación de la fluorescencia significa una nueva síntesis de proteínas en células y/o tejidos de interés. Por lo tanto, la combinación de nematodos transgénicos, intervenciones genéticas y/o farmacológicas junto con imágenes vivas de las tasas de síntesis de proteínas puede arrojar luz sobre los mecanismos que median el colapso de la proteostasis dependiente de la edad.
Introduction
La síntesis y degradación de proteínas es esencial para la homeostasis organismal. Una multitud de enfermedades relacionadas con la edad son instigadas por la producción de proteínasdefectuosas 1,2. Con el fin de medir las tasas globales de traducción de proteínas, existen técnicas bioquímicas como el perfil ribosomal, que implica la secuenciación profunda de fragmentos de ARNm protegidos contra ribosomas para monitorear la expresión, así como la nueva síntesis de proteínas3. Este método, además de ser una lectura indirecta de las tasas de traslación, ya que el aumento de la asociación de ARN a los ribosomas no significa necesariamente un aumento de la traducción, tiene desventajas técnicas, como un alto costo y un requisito de una gran cantidad de material de partida. Por otro lado, los métodos basados en proteómica permiten la cuantificación directa de proteínas mediante perfiles metabólicos de pulso seguidos de análisis de espectrometría de masas4,,5. Sin embargo, se trata de un enfoque semicuantitativo con resolución temporal limitada que no se puede utilizar fácilmente in vivo. Además, el etiquetado de la proteína puede distribuirse de manera desigual en el animal/tejido de interés. Es importante destacar que ambos métodos pueden ocultar variaciones específicas de los tejidos o de las células en las tasas de traducción de proteínas en animales o tejidos enteros, respectivamente.
Caenorhabditis elegans es un organismo modelo fácil de usar que se puede cultivar en grandes cantidades6. Además, su sostenibilidad genética y transparencia permiten obtener imágenes en vivo in vivo. Este protocolo describe la metodología para detectar las tasas de síntesis de proteínas utilizando la recuperación de fluorescencia después del fotoblancarte (FRAP). Aprovechamos la expresión transgénica de proteínas fluorescentes, ya sea en todo el organismo o en tejidos/células específicos. Los animales transgénicos pueden expresar la GFP utilizando el promotor de un gen, que se expresa ampliamente/globalmente o un promotor específico del tejido para atacar tipos celulares específicos. Esta técnica se puede extender a un promotor específico para examinar las tasas de síntesis de proteínas de una proteína específica.
Protocol
Representative Results
Discussion
La modulación de síntesis de proteínas es esencial para la homeostasis organismal. Durante el envejecimiento, se perturba la síntesis de proteínas globales y específicas. Estudios recientes revelan el hecho de que el equilibrio de traducción de proteínas controla directamente la senescencia y el envejecimiento no es simplemente un subproducto del proceso de envejecimiento. En particular, los componentes básicos de la maquinaria de traducción, como el factor de iniciación eucariota 4E (eIF4E), que facilita el t…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Chaniotakis M. y Kounakis K. por la grabación y edición de vídeo. K.P. está financiado por una subvención de la Fundación Helénica para la Investigación y la Innovación (HFRI) y la Secretaría General de Investigación y Tecnología (GSRT). N.T. está financiado por subvenciones del Consejo Europeo de Investigación (ERC – GA695190 – MANNA), los Programas Marco de la Comisión Europea y el Ministerio de Educación de Grecia.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
Referencias
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, 75-89 (2015).
- Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
- Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genética. 200 (2), 387-407 (2015).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo. PLoS One. 4 (2), 4547 (2009).
- Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
- Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
- Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).
- Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).
- Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).
