In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex door In Utero Electroporation
Summary
Hier gepresenteerd is een protocol om genetische manipulatie uit te voeren in de embryonale fret hersenen met behulp van in utero elektroporatie. Deze methode maakt het mogelijk om neurale voorlopercellen in de neocortex in vivo te targeten.
Abstract
Manipulatie van genexpressie in vivo tijdens de embryonale ontwikkeling is de methode van keuze bij het analyseren van de rol van individuele genen tijdens de ontwikkeling van zoogdieren. In utero elektroporatie is een belangrijke techniek voor de manipulatie van genexpressie in de embryonale zoogdier hersenen in vivo. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor in utero elektroporatie van de embryonale neocortex van fretten, een kleine carnivoor. De fret wordt steeds vaker gebruikt als een model voor neocortex ontwikkeling, omdat de neocortex vertoont een reeks van anatomische, histologische, cellulaire, en moleculaire kenmerken die ook aanwezig zijn in menselijke en niet-menselijke primaten, maar afwezig in knaagdier modellen, zoals muis of rat. In utero elektroporatie werd uitgevoerd op embryonale dag (E) 33, een midneurogenese stadium in fret. In utero elektroporatie richt neurale voorloper cellen langs de laterale ventrikels van de hersenen. Tijdens neurogenese, deze voorloper cellen aanleiding geven tot alle andere neurale celtypes. Dit werk toont representatieve resultaten en analyses op E37, postnatale dag (P) 1 en P16, wat overeenkomt met respectievelijk 4, 9 en 24 dagen na utero-elektroporatie. In eerdere stadia bestaat het nageslacht van gerichte cellen voornamelijk uit verschillende neurale voorloper subtypes, terwijl in latere stadia de meeste gelabelde cellen postmitotische neuronen zijn. Dus, in utero elektroporatie maakt de studie van het effect van genetische manipulatie op de cellulaire en moleculaire kenmerken van verschillende soorten neurale cellen. Door het effect ervan op verschillende celpopulaties, in utero elektroporatie kan ook worden gebruikt voor de manipulatie van histologische en anatomische kenmerken van de fret neocortex. Belangrijk is dat al deze effecten acuut zijn en worden uitgevoerd met een spatiotemporale specificiteit bepaald door de gebruiker.
Introduction
De neocortex is het buitenste blad van de zoogdiercerebrum en de zetel van hogere cognitieve functies1,2,3,4,5. Om een acute genetische manipulatie in de zoogdiernetrocortex in vivo te bereiken tijdens de embryonale ontwikkeling, zijn twee verschillende methoden onderzocht: virale infectie6 en in utero elektroporatie7. Beide methoden maken efficiënte targeting van neocorticale cellen mogelijk, maar hebben last van enkele beperkingen. Het grote voordeel van in utero elektroporatie in vergelijking met virale infectie is het vermogen om ruimtelijke specificiteit te bereiken binnen de neocortex, die wordt bereikt door het reguleren van de richting van het elektrische veld.
Sinds elektroporatie voor het eerst werd aangetoond dat het de binnenkomst van DNA in de cellen in vitro8vergemakkelijkt, is het toegepast om DNA te leveren in verschillende gewervelde dieren in vivo. In de ontwikkelingsneurowetenschappen werd in utero-elektroporatie van de muis neocortex voor het eerst gemeld in 20019,10. Deze methode bestaat uit een injectie van het DNA-mengsel in de laterale ventrikel van de embryonale hersenen en de daaropvolgende toepassing van het elektrische veld met behulp van pincet-elektroden, die ruimtelijke precisie7,11mogelijk maakt . In utero elektroporatie is sindsdien toegepast om nucleïnezuren te leveren om de expressie van endogene of ectopisch toegevoegde genen in de muis neocortex te manipuleren. Belangrijke vooruitgang is onlangs geboekt door de toepassing van de methodologie van CRISPR/ Cas9-gemedieerde genoombewerking via in utero elektroporatie in de muis neocortex uit te voeren (1) genverstoring in postmitotische neuronen12,,13 en neurale voorloper cellen14, en (2) genoom15 en epigenome16 bewerken.
Zeer snel na het eerste rapport in de muis, in utero elektroporatie werd toegepast op de embryonale rat neocortex17,18. Niet-knaagdieren bleven een uitdaging tot de eerste in utero elektroporatie van fretten, een kleine carnivoor, werd gemeld in 201219,20. Sindsdien is in utero elektroporatie van fretten toegepast om de mechanismen van neocortexontwikkeling te bestuderen door neurale voorlopers en neuronen20,21 ,22,2223,te manipuleren, waarbij de expressie van endogene genen wordt gemanipuleerd, inclusief het gebruik van CRISPR/Cas9-technologie24, en door ectopische genen te leveren21,22,25, inclusief mensspecifieke genen26. Bovendien is in utero-elektroporatie van fretten gebruikt om kenmerken van de ontwikkeling van menselijke neocortex in pathologische omstandigheden27,28aan te pakken .
In de context van de ontwikkeling van neocortex zijn de voordelen van het gebruik van fretten als modelorganisme ten opzichte van muizen te wijten aan het feit dat fretten een reeks menselijke kenmerken beter samenvatten. Op anatomisch niveau vertonen fretten een karakteristiek patroon van corticale vouwen, dat ook aanwezig is in menselijke en meeste andere primaten, maar volledig afwezig is bij muizen of ratten4,29,30,31. Op histologisch niveau hebben fretten twee verschillende subventriculaire kiminale zones, aangeduid als de binnenste en buitenste subventriculaire zones (respectievelijk ISVZ en OSVZ)32,33, gescheiden door de binnenste vezellaag23. Deze functies worden ook gedeeld met primaten, waaronder mensen, maar niet met muizen34. De ISVZ en OSVZ in fretten en mensen zijn bevolkt met overvloedige neurale voorlopercellen, terwijl de subventriculaire zone (SVZ) van muizen bevat slechts schaarse neurale voorlopers21,32,35,36. Op cellulair niveau vertonen fretten een groot deel van een subtype neurale voorlopers die respectievelijk basale of buitenste radialeglia (bRG of oRG) worden genoemd, die als instrumenteel worden beschouwd voor de evolutionaire expansie van de zoogdiernecitator34,37,38. bRG zijn dus zeer overvloedig in de foetale menselijke en embryonale fret neocortex, maar ze zijn zeer zeldzaam in de embryonale muis neocortex35,36. Bovendien vertoont ferret bRG morfologische heterogeniteit vergelijkbaar met die van de menselijke bRG, veel beter dan muis bRG21. Ten slotte vertoont de ontwikkeling van fret neocortex op moleculair niveau genexpressiepatronen die sterk lijken op die van foetale menselijke neocortex, waarvan wordt aangenomen dat ze de ontwikkeling van corticale vouwen controleren, onder andere39.
De cel biologische en moleculaire kenmerken van fret bRG maken ze zeer proliferative, vergelijkbaar met de menselijke bRG. Dit resulteert in een verhoogde productie van neuronen en de ontwikkeling van een uitgebreide en zeer complexe neocortex34. Deze kenmerken maken fretten uitstekend model organismen voor het bestuderen van mens-achtige kenmerken van neocortex ontwikkeling die niet kunnen worden gemodelleerd in muizen26,40. Om optimaal gebruik te maken van de fret als modelorganisme werd de gepresenteerde methode ontwikkeld. Het bestaat uit in utero elektroporatie van E33 fret embryo’s met een plasmide uitdrukken GFP (pGFP) onder de controle van een alomtegenwoordige promotor, CAG. De geëlektreerde embryo’s kunnen vervolgens embryonaal of postnatally worden geanalyseerd. Om het aantal geofferde dieren te verminderen, worden vrouwelijke fretten (jills) gesteriliseerd door hysterectomie en gedoneerd voor adoptie als huisdier. Als de beoogde embryo’s in embryonale stadia worden geoogst, wordt een tweede operatie uitgevoerd en worden de embryo’s verwijderd door een keizersnede, terwijl de jills hysterectomized zijn. Als de beoogde embryo’s worden geanalyseerd in postnatale stadia, worden de jills hysterectomized nadat de pups zijn gespeend of geofferd. Daarom wordt ook een protocol gepresenteerd voor de hysterectomie van jills.
Protocol
Representative Results
Discussion
In utero elektroporatie in fret is een belangrijke techniek, met voor- en nadelen met betrekking tot andere methoden. Er zijn kritieke stappen en beperkingen aan deze methode, evenals mogelijke wijzigingen en toekomstige toepassingen om in gedachten te houden.
Sinds het pionierswerk van Victor Borrell en collega’s over genetische manipulatie van de postnatale fret neocortex via elektroporatie of virale injectie35,42,<sup cla…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn de diensten en faciliteiten van het Max Planck Instituut voor Moleculaire Celbiologie en Genetica dankbaar voor de uitstekende ondersteuning, met name het hele team van de Biomedische diensten (BMS) voor de uitstekende veeteelt van fretten en J. Peychl en zijn team van de Light Microscopie Facility. We zijn Katrin Reppe en Anna Pfeffer van het BMS bijzonder dankbaar voor uitzonderlijke veterinaire ondersteuning en Lei Xing van de Huttner-groep voor het assisteren bij fretoperaties.
Materials
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
Referencias
- Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B., Kaas, J. . Evolution of Nervous Systems 2e. 3, 73-89 (2017).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
- Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification. Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).
- Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Molnar, Z., et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).
- Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biología del desarrollo. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociencias. 103 (4), 865-872 (2001).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e239 (2007).
- Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
- Shinmyo, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Science Reports. 6, 20611 (2016).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e236 (2007).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5, 24 (2012).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).
- Martinez-Martinez, M. A., et al. A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels. Nature Communication. 7, 11812 (2016).
- Saito, K., et al. Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets. Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).
- Shinmyo, Y., et al. Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals. Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).
- Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain. Elife. 6, 29285 (2017).
- Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, 41241 (2018).
- Masuda, K., et al. Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals. Science Reports. 5, 15370 (2015).
- Matsumoto, N., et al. Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals. Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of brain development in the ferret via MRI. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes. Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).
- Sawada, K., Watanabe, M. Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius). Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).
- Reillo, I., Borrell, V. Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors. Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes. Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).
- Borrell, V., Reillo, I. Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution. Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).
- Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Fietz, S. A., Huttner, W. B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).
- De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly. EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).
- Kawasaki, H. Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets. Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Borrell, V. In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).
- Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex. Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).
- Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
- Vaid, S., et al. A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex. Development. 145 (20), 169276 (2018).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nature Communications. 4, 2125 (2013).
