インビボ子宮内電気ポレーションによるフェレット新皮質における神経前駆細胞の標的化
Summary
ここで提示されるのが、子宮エレクトロポレーションで使用する胚フェレット脳における遺伝子操作を行うプロトコルである。この方法は、生体内の新皮質における神経前駆細胞の標的化を可能にする。
Abstract
胚発生時の生体内での遺伝子発現の操作は、哺乳動物の発達中に個々の遺伝子の役割を分析する際に選択する方法である。子宮内エレクトロポレーションは、生体内の胚哺乳類脳における遺伝子発現の操作に関する重要な技術である。小さな食動物であるフェレットの胚性新皮質の子宮内電気散挿のためのプロトコルがここに提示される。フェレットは、新皮質がヒトおよび非ヒト霊長類にも存在する一連の解剖学的、組織学的、細胞的、分子的特徴を示すが、マウスやラットなどのげっ歯類モデルには存在しないため、新皮質開発のモデルとしてますます使用されている。子宮内電気ポレーションでは、フェレット中発性の中発性ステージである胚期(E)33で行った。子宮内電気ポレーションでは、脳の側心室を裏打ちする神経前駆細胞を標的とする。神経新生の間に、これらの前駆細胞は他のすべての神経細胞タイプを生み出す。この研究は、E37、出生後(P)1、およびP16において、それぞれ子宮エレクトロポレーション後4、9、および24日後に対応する代表的な結果と分析を示す。初期の段階では、標的細胞の子孫は主に様々な神経前駆細胞サブタイプからなり、後の段階ではほとんどの標識細胞がポストミトジンクニューロンである。このように、子宮エレクトロポレーションでは、様々なタイプの神経細胞の細胞および分子特徴に対する遺伝子操作の効果の研究が可能になる。様々な細胞集団に対するその効果を通じて、子宮エレクトロポレーションでは、フェレット新皮質の組織学的および解剖学的特徴の操作にも使用することができる。重要なことに、これらすべての効果は急性であり、ユーザーによって決定される時空間的特異性で行われる。
Introduction
新皮質は哺乳類大脳の外側のシートであり、高い認知機能の座席,21、2、3、4、53,4,5である。胚発生時に生体内で哺乳動物新皮質で急性の遺伝子操作を達成するために、ウイルス感染6および子宮エレクトロポレーション7の2つの異なる方法が検討されている。どちらの方法も新皮質細胞の効率的な標的化を可能にするが、いくつかの制限に苦しんでいる。ウイルス感染と比較して子宮エレクトロポレーションにおける主な利点は、電界の方向を調節することによって達成される新皮質内の空間特異性を達成する能力である。
エレクトロポレーションは、インビトロ8で細胞へのDNAの侵入を容易にすることが最初に示されたことから、生体内の様々な脊椎動物にDNAを送達するために適用されている。発達神経科学では、マウス新皮質の子宮エレクトロポレーションが2001年9年に10初めて報告された。この方法は、胚性脳の側心室におけるDNA混合物の注入と、その後のテキサ電極を用いた電界の適用7からなる。子宮内エレクトロポレーションでは、マウス新皮質中の内在性または異所性付加遺伝子の発現を操作するために核酸を送達するために適用されている。最近、マウス新皮質における子宮内電気ポレーションによるCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集の方法論を適用し、後味ニューロン12、13および神経前駆細胞14、および(2)ゲノム1215およびエピゲノム16編集において(1)遺伝子破壊を行うことで重要な進歩15が見られた。
マウスの最初の報告の直後に、子宮内のエレクトロポレーションが胚性ラット新皮質17,18,18に適用された。非げっ歯類は、フェレットの子宮エレクトロポレーションの最初のまで挑戦のままでした, 小さな食動物, で報告されました2012 19,,20.それ以来、フェレットの子宮エレクトロポレーションでは、神経前駆物質とニューロン20、21、22、23を標識し21,22,23、CRISPR/Cas9,技術24の使用を含む内因性遺伝子の発現を操作し、ヒト特異的20遺伝子21、22、25、ヒト特異的遺伝子を含むヒト特異性遺伝子を含21,22む神経皮質発達のメカニズムを研究するために応用されてきた。,25さらに、フェレットの子宮エレクトロポレーションにおいて、病理学的状態27,28,28におけるヒト新皮質の発達の特徴に対処するために用いられてきた。
新皮質の発達の文脈では、フェレットをマウスと比較してモデル生物として使用することの利点は、フェレットが一連の人間のような特徴をよりよく再現するという事実によるものです。解剖学的レベルでは、フェレットは、ヒトおよび他のほとんどの霊長類にも存在する皮質折りたたみの特徴的なパターンを示すが、マウスまたはラット44、29、30、3129,30,31には完全に存在しない。組織学的レベルではフェレットは、2つの異なる心室下胚芽帯を有し、内側および外側の心室領域(それぞれISVZおよびOSVZ)32、33、内32,33繊維層23によって分離される。これらの機能は、ヒトを含む霊長類とも共有されますが、マウス34では共有されません。フェレットおよびヒトのISVZおよびOSVZには豊富な神経前駆細胞が含まれているのに対し、マウスの心室領域(SVZ)は疎神経前駆物質21、32、35、3632,35,36のみを含む。21細胞レベルでは、フェレットは、哺乳類新皮質34、37、38,37,38の進化的拡張に役立つと考えられる基底または外径神経グリア(それぞれbRGまたはoRG)と呼ばれる神経前駆体のサブタイプの高い割合を示す。bRGは、したがって胎児のヒトおよび胚性フェレット新皮質に非常に豊富であるが、それらは胚マウス新皮質35、36,36では非常にまれである。さらに、フェレットbRGは、ヒトbRGの形態学的不均一性と同様の形態学的不均一性を示し、マウスbRG21に対してはるかに優れている。最後に、分子レベルで、フェレット新皮質の開発は、皮質フォールディングの発症を制御すると推測される胎児ヒト新皮質のものと非常によく似た遺伝子発現パターンを示す。とりわけ39。
フェレットbRGの細胞の生物学的および分子的特性は、ヒトbRGと同様に、それらを高度に増殖させる。これはニューロンの増加の生産と拡張され、非常に複雑な新皮質の開発に34.これらの特性は、マウス26,40,40ではモデル化できない新皮質発達の人間のような特徴を研究するための優れたモデル生物をフェレットにする。フェレットをモデル生物として最大限に活用するために、提示された方法が開発された。これは、ユビキタスプロモーターであるCAGの制御下でGFP(pGFP)を発現するプラスミドを有するE33フェレット胚の子宮エレクトロポレーションで構成される。電気電化胚は、胚または出生後に分析することができる。殺された動物の数を減らすために、雌のフェレット(ジル)は子宮摘出術によって殺菌され、ペットとして養子縁組のために寄付される。標的胚が胚期に収穫された場合、第二の手術が行われ、胚は帝王切開によって除去され、ジルは子宮摘出される。標的胚が出生後の段階で分析される場合、ジズは子犬が脱後または犠牲になった後に子宮摘出される。したがって、ジルの子宮摘出のためのプロトコルも提示される。
Protocol
Representative Results
Discussion
フェレットにおける子宮エレクトロポレーションでは、他の方法に関しては利点と欠点を有する重要な技術である。この方法には、重要な手順と制限事項、潜在的な変更、将来のアプリケーションが考慮されます。
Victor Borrellたちの先駆的な研究は、エレクトロポレーションまたはウイルス注射35、42、4342,43による出生…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
マックスプランク分子細胞生物学遺伝学研究所のサービスと施設に感謝し、フェレットとJ.ペイクルの優れた畜産と軽顕微鏡施設の彼のチームのために生物医学サービス(BMS)のチーム全体が提供された優れたサポートを提供しました。特に、BMSのカトリン・レッペとアンナ・プフェファーが優れた獣医支援をしてくれたことに感謝し、フットナー・グループのレイ・シンがフェレット手術を支援してくれたことに感謝しています。
Materials
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
Referencias
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