Vorbereitung von Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues derived from Human iPS Cells for In Vivo Myokard repair
Summary
Das vorliegende Protokoll erzeugt netzförmige stämmige Herzgewebe, das kardiovaskuläre Zellen enthält, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden, um die Untersuchung der Zellimplantationstherapie für Herzkrankheiten zu ermöglichen.
Abstract
Das aktuelle Protokoll beschreibt Methoden zur Erzeugung skalierbarer, netzförmiger Herzgewebe (ECTs), die aus kardiovaskulären Zellen bestehen, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) gewonnen werden und auf das Ziel der klinischen Anwendung hin entwickelt werden. HiPSC-abgeleitete Kardiomyozyten, Endothelzellen und vaskuläre Wandzellen werden mit Gelmatrix vermischt und dann in eine Polydimethylsiloxan (PDMS) Gewebeform mit rechteckigen inneren versetzten Pfosten gegossen. Am Kulturtag reifen 14 ECTs zu einer 1,5 cm x 1,5 cm Maschenöffnung mit Myofiberbündeln mit 0,5 mm Durchmesser. Cardiomyozyten richten sich an der Langachse jedes Bündels aus und schlagen spontan synchron. Dieser Ansatz kann auf einen größeren (3,0 cm x 3,0 cm) Mesh-ECT skaliert werden, wobei die Konstruktreifung und -funktion erhalten bleibt. So können netzförmige ECTs, die aus hiPSC-abgeleiteten Herzzellen erzeugt werden, für Kardialregenerationsparadigmen möglich sein.
Introduction
Zahlreiche präklinische Studien und klinische Studien haben die Effizienz zellbasierter herzregenerativer Therapien bei versagenden Herzen1,2,3bestätigt. Unter verschiedenen Zelltypen sind humaninduzierte pluripotente Stammzellen (HiPSCs) vielversprechende Zellquellen aufgrund ihrer proliferativen Fähigkeit, des Potenzials, verschiedene kardiovaskuläre Linien4,,5, und Allogenität zu erzeugen. Darüber hinaus haben Gewebe-Engineering-Technologien es möglich gemacht, Millionen von Zellen auf ein geschädigtes Herz zu übertragen5,6,7,8.
Zuvor berichteten wir über die Erzeugung dreidimensionaler (3D) linearer Herzgewebe (ECTs) aus hiPSC-abgeleiteten kardiovaskulären Linien mit einem kommerziell erhältlichen Kultursystem für biokünstliche 3D-Gewebe5,7. Wir fanden heraus, dass die Koexistenz von vaskulären Endothelzellen und Wandzellen mit Kardiomyozyten innerhalb des ECT die strukturelle und elektrophysiologische Gewebereifung erleichterte. Darüber hinaus haben wir das therapeutische Potenzial implantierter HiPSC-ECTs in einem immuntoleranten Myokardinfarktmodell der Ratte validiert, um die Herzfunktion zu verbessern, Myokard zu regenerieren und die Angiogenese zu verbessern5. Die nach diesem Verfahren konstruierten linearen ECTs waren jedoch 1 mm x 10 mm Zylinder und daher nicht für die Implantation in präklinischen Studien mit größeren Tieren oder der klinischen Anwendung geeignet.
Basierend auf der erfolgreichen Verwendung von Gewebeformen zur Erzeugung poröser, konstruierter Gewebebildung mit Ratenskelettmyoblasten und Kardiomyozyten9, humanen ESC-abgeleiteten Kardiomyozyten10 und Maus-iPSCs11, haben wir ein Protokoll entwickelt, um skalierbares, von HiPSC abgeleitetes größeres implantierbares Gewebe mit Polydimethylsiloxan (PDMS)-Formen zu erzeugen. Wir haben eine Reihe von Formgeometrien ausgewertet, um die effektivsten Werkzeugeigenschaften zu bestimmen. Mesh-förmige ECTs mit mehreren Bündeln und Knoten wiesen hervorragende Eigenschaften in Zelllebensfähigkeit, Gewebefunktion und Skalierbarkeit im Vergleich zu einfachen Oder linearen Formaten auf, denen Poren oder Knoten fehlten. Wir implantierten die netzförmige ECT in ein Myokardinfarktmodell der Ratte und bestätigten ihre therapeutische Wirkung ähnlich den implantierten zylindrischen ECTs12. Hier beschreiben wir das Protokoll zur Erzeugung eines hiPSC-abgeleiteten netzförmigen ECT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nach Abschluss unserer Untersuchung eines linearen Formats, hiPSC abgeleitet ECT5, passten wir das Protokoll an, um hiPSC-abgeleitete CMs, ECs und MCs zu mischen, um die In-vitro-Expansion von Gefäßzellen innerhalb von ECTs und die anschließende in vivo-Gefäßkopplung zwischen ECTs und Empfängermyokard zu erleichtern.
Um die Erzeugung größerer, implantierbarer Netz-ECT-Geometrien zu erleichtern, verwendeten wir dünne PDMS-Platten, um die 3D-Formen mit Ladepfoste…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Kosair Charities Pediatric Heart Research Program an der University of Louisville und das Organoid Project am RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research finanziell unterstützt. HiPSCs, die in unseren veröffentlichten Protokollen verwendet werden, wurden vom Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Japan bereitgestellt.
Materials
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100×20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
Referencias
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