Preparación de tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla derivados de células iPS humanas para la reparación del miocardio In Vivo

Summary

El presente protocolo genera tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla que contienen células cardiovasculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para permitir la investigación de la terapia de implantación celular para enfermedades del corazón.

Abstract

El protocolo actual describe métodos para generar tejidos cardíacos (ECT) de ingeniería en forma de malla escalables compuestos por células cardiovasculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC), que se desarrollan hacia el objetivo del uso clínico. Los cardiomiocitos derivados de HiPSC, las células endoteliales y las células murales vasculares se mezclan con matriz de gel y luego se vierten en un molde de tejido de polidimetilsiloxano (PDMS) con postes escalonados internos rectangulares. Por día de cultivo 14 ECT maduran en una estructura de malla de 1,5 cm x 1,5 cm con paquetes de miofibra de 0,5 mm de diámetro. Los cardiomiocitos se alinean con el eje largo de cada haz y golpean espontáneamente sincrónicamente. Este enfoque se puede escalar hasta un ECT de malla más grande (3,0 cm x 3,0 cm) conservando la maduración y función de construcción. Por lo tanto, los ECT en forma de malla generados a partir de células cardíacas derivadas de hiPSC pueden ser factibles para los paradigmas de regeneración cardíaca.

Introduction

Numerosos estudios preclínicos y ensayos clínicos han confirmado la eficiencia de las terapias regenerativas cardíacas basadas en células para corazones en quiebra^1,2,3. Entre varios tipos de células, las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) son fuentes celulares prometedoras en virtud de su capacidad proliferativa, potencial para generar varios linajes cardiovasculares^4,,5,y alogenicidad. Además, las tecnologías de ingeniería de tejidos han hecho posible transferir millones de células a un corazó....

Protocol

1. Mantenimiento de hiPSC y diferenciación cardiovascular

1. Ampliar y mantener hiPSCs en la matriz de membrana del sótano de capa delgada (factor de crecimiento reducido, 1:60 dilución) en medio condicionado extraído de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF-CM) con factor de crecimiento de fibroblastos básico humano (hbFGF)⁴.
   NOTA: Utilizamos una línea hiPSCs (4 factores (Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc): 201B6). Agregue hbFGF a la concentración adecuada para cada línea celular. El fragmento de Laminin-511 también se puede utilizar para el recubrimiento de la placa de cultivo en lugar de la matriz de membrana del sótano. El medio dispon....

Results

El cuadro 1A, B muestra los esquemas del protocolo CM+EC y MC. Después de inducir los CM y los FC del protocolo CM+EC y los MC del protocolo MC, las células se mezclan ajustando las concentraciones finales de MC para representar entre el 10 y el 20% del total de células. El molde de tejido de 2 cm de ancho se fabrica de acuerdo con el dibujo de diseño de una hoja PDMS de 0,5 mm de espesor(Figura 2A,B). Seis millones de células C.......

Discussion

Tras la finalización de nuestra investigación de un formato lineal, derivado de hiPSC ECT^5,adaptamos el protocolo para mezclar CM, EC y MC derivados de hiPSC para facilitar la expansión in vitro de las células vasculares dentro de las ECT y el posterior acoplamiento vascular in vivo entre las ECT y el miocardio receptor.

Para facilitar la generación de geometrías ECT de malla más grandes e implantables, utilizamos láminas delgadas de PDMS para diseñar los moldes 3D con .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
mm estilo	Falcon/ Thomas scientific	9380C51
Placas de pocillos múltiples para cultivo celular 6well 50/CS	Falcon / Thomas scientific	6902A01
Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona	Dow Corning	761036
Accumax	Innovative Cell Technologies	AM-105
BMP4, recombinantes (10µ g)	R& D	RSD-314-BP-010
Colágeno, solución tipo I de cola de rata	Sigma	C3867
Matrigel	Corning	reducido en
VEGF humano (165) IS, grado premium	Miltenyi	130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 y micro; m filtrado (solución al 10% en agua)	Sondas moleculares	P-6866
bFGF humano recombinante	WAKO	060-04543
ActivinA recombinante humano/ratón/rata (50µ g)	R& D	338-AC-050
rh Wnt-3a (10µ g)	R& D	5036-WN
Versene solución	Gibco	15040066
Medio de cultivo y suplementos
10x MEM	Invitrogen	11430
2 Mercaptro Etanol	SIGMA	M6250
B27 suplemento sin insulina	Gibco
DMEM,	Gibco	11965084
Suero Fetal Bovino Alto en Glucosa (500 ml)	Cualquier
Suero Fetal Bovino (500 ml)	Cualquier
L-Glutamina	Gibco	25030081
NaHCO3	Cualquier
PBS 1x	Gibco	10010-031
Penicilina-estreptomicina (5000 U/mL)	Gibco	15070-063
RPMI1640 medio	Gibco	21870092
α MEM	Invitrogen	11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clon: TRA-1-60, BD Biosciences	BD / Fisher	560380
anti-troponina T, Isoforma cardíaca Ab-1, Clon: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision	Fisher	MS-295-P0
BD FACS Clean Solución	BD	340345
BD FACSFo fluido de funda baja	BD	342003
BD FACSRina Solución	BD	340346
EDTA	Cualquier
Tubo Falcon con Tapa de Filtro de Células (Caja de 500)	Suero	352235
(500ml)	Cualquiera
Kit de tinción de células muertas Aqua LIVE/DEAD fijable, para excitación de 405 nm	Sondas moleculares	L34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clon: 28D4, BD Biosciences	BD / Fisher	558821
Saponina	Sigma-Aldrich	47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clon: 55-7H1, BD Biosciences	BD / Fisher	560411
Zenon Alexa Fluor 488 Ratón IgG1 Kit de etiquetado	Sondas moleculares	Z25002