Подготовка сетчатой формы инженерных сердечных тканей, полученных из человеческих клеток iPS для ремонта миокарда In Vivo
Summary
Настоящий протокол генерирует сетчатой формы инженерии сердечных тканей, содержащих сердечно-сосудистые клетки, полученные из человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, чтобы исследование клеточной имплантации терапии сердечных заболеваний.
Abstract
Текущий протокол описывает методы для создания масштабируемых, сетчатой формы инженерии сердечных тканей (ECTs), состоящий из сердечно-сосудистых клеток, полученных из человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), которые разработаны в направлении цели клинического использования. HiPSC полученных кардиомиоцитов, эндотелиальных клеток и сосудистых клеток фрески смешиваются с гель матрицы, а затем вылил в полидиметилсилоксана (PDMS) ткани формы с прямоугольными внутренними шахматной должностей. По культуре день 14 ECTs созревают в 1,5 см х 1,5 см сетки структуры с 0,5 мм диаметром миофибер расслоения. Кардиомиоциты выравниваются к длинной оси каждого пучка и спонтанно бьют синхронно. Этот подход может быть увеличен до большего (3,0 см х 3,0 см) сетки ЭСТ при сохранении созревания конструкции и функции. Таким образом, сетчатые ЭКТы, генерируемые из сердечных клеток, полученных из hiPSC, могут быть осуществимы для парадигм регенерации сердца.
Introduction
Многочисленные доклинические исследования и клинические испытания подтвердили эффективность клеточной сердечной регенеративной терапии для отказасердца 1,2,3. Среди различных типов клеток, человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) являются перспективными источниками клеток в силу их пролиферативной способности,потенциал для создания различных сердечно-сосудистых линий 4,5, и алогенности. Кроме того, технологии тканевой инженерии сделали возможным перенос миллионов клеток на поврежденное сердце5,,6,,7,,8.
Ранее мы сообщали о генерации трехмерных (3D) линейных инженерных сердечных тканей (ЭКТ) из сердечно-сосудистых линий, полученных из hiPSC, с использованием коммерчески доступной системы культуры для 3D биоискусныхтканей 5,7. Мы обнаружили, что сосуществование сосудистых эндотелиальных клеток и фресок с кардиомиоцитами в рамках ЭСТ облегчает созревание структурных и электрофизиологических тканей. Кроме того, мы подтвердили терапевтический потенциал имплантированных hiPSC-ECTs в иммунной толерантной модели инфаркта крыс миокарда для улучшения сердечной функции, регенерации миокарда, и повышения ангиогенеза5. Тем не менее, линейные ЭКТ, построенные этим методом, были 1 мм на 10 мм цилиндрами и поэтому не подходили для имплантации в доклинических исследованиях с более крупными животными или клиническом использовании.
Основываясь на успешном использовании тканевых форм для генерации пористой инженерии формирования тканей с использованием крыс скелетныхмиобластов и кардиомиоцитов 9, человека ESC полученных кардиомиоцитов10 и мыши iPSCs11, мы разработали протокол для создания масштабируемых hiPSC полученных больших имплантируемых тканей с использованием полидиметилсилоксана (PDMS) формы. Мы оценили ряд геометрий плесени, чтобы определить наиболее эффективные характеристики плесени. Сетчатые ЭКТ с несколькими пучками и соединениями продемонстрировали отличные характеристики в жизнеспособности клеток, функции тканей и масштабируемости по сравнению с простым листом или линейными форматами, в которых отсутствовали поры или соединения. Мы имплантировали СЕТ в форме сетки в модель инфаркта миокарда крысы и подтвердили его терапевтические эффекты, похожие на имплантированные цилиндрическиеЭКТ 12. Здесь мы описываем протокол для создания СЕТ в форме сетки, полученной от hiPSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
После завершения нашего исследования линейного формата, hiPSC производных ЭСТ5, мы адаптировали протокол для смешивания hiPSC полученных CMs, ECs, и MCs для облегчения в пробирке расширение сосудистых клеток в РАМКАХ ИТС и последующего в виво сосудистой связи между ECTs и получателя м…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была финансово поддержана Kosair Благотворительные педиатрические исследования сердца программы в Университете Луисвилла и органоидный проект в RIKEN Центр биосистемных исследований динамики. HiPSCs, используемые в наших опубликованных протоколах, были предоставлены Центром исследований и применения клеток iPS, Киотский университет, Киото, Япония.
Materials
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100×20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
Referencias
- Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
- Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure. Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).
- Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1. European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).
- Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Scientific Reports. 4, 6716 (2014).
- Masumoto, H., et al. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Scientific Reports. 6, 29933 (2016).
- Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).
- Fujimoto, K. L., et al. Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function. Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).
- Lancaster, J. J., et al. Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue. Vessel Plus. 2019, (2019).
- Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues. Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
- Christoforou, N., et al. Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues. PloS one. 8, 65963 (2013).
- Nakane, T., et al. Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue. Scientific Reports. 7, 45641 (2017).
- Kowalski, W. J., et al. Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue. Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).
